四重?zé)晒舛縭RT-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒B1、B2、B3及其他腸道病毒方法學(xué)的研究及應(yīng)用.pdf

1、柯薩奇病毒(coxsackievirus，CV)是一種腸道病毒(enterovirus，EV)，分為A和B兩類(lèi)血清型，B組有6型病毒。柯薩奇病毒B組可引起呼吸道感染、腹瀉、腦膜炎、心肌炎、新生兒嚴(yán)重感染等，尤其是病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)最常見(jiàn)的原因。病毒性心肌炎也可由其他腸道病毒引起。目前對(duì)病毒性心肌炎的臨床診斷，主要依靠臨床癥狀及常規(guī)生化檢查和心電圖，但是由于病毒性心肌炎發(fā)病初期的癥狀不典型，往往出現(xiàn)

2、臨床癥狀時(shí)已經(jīng)累及心肌，引起心肌不可逆的損傷，造成嚴(yán)重后果。雖然血清學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于診斷病毒感染，但無(wú)法明確診斷感染病毒的種類(lèi)。本研究通過(guò)對(duì)柯薩奇病毒B1，B2，B3及其他腸道病毒保守區(qū)基因序列進(jìn)行分析，分別設(shè)計(jì)高度特異性的引物與Taqman探針，建立了四重?zé)晒舛縭RT-PCR，采用一步法可同時(shí)檢測(cè)CoxB1、CoxB2、CoxB3以及其他腸道病毒。本研究分二部分:第一部分為四重?zé)晒舛縭RT-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒B1、B2、B3

3、及其他腸道病毒方法的建立;第二部分為四重?zé)晒舛縭RT-PCR法的臨床應(yīng)用。
　　第一部分四重?zé)晒舛縭RT-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒B1、B2、B3及其他腸道病毒方法的建立
　　1.方法:
　　(1)從美國(guó)的NCBI基因庫(kù)下載了涵蓋國(guó)內(nèi)外CoxB1、CoxB2、CoxB3以及腸道病毒的多條基因序列。利用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區(qū)。使用Primer Express3.0軟件在其保守區(qū)

4、設(shè)計(jì)高度特異性的引物與Taqman探針，引物和探針序列均通過(guò)Blast驗(yàn)證。
　　(2)優(yōu)化反應(yīng)體系，利用CoxB1、CoxB2、CoxB3核酸片段和輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16等分離株評(píng)價(jià)該法的特異性，對(duì)已標(biāo)定拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品（相應(yīng)質(zhì)粒）進(jìn)行稀釋?zhuān)叫羞M(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。
　　(3)此外，對(duì)每一個(gè)濃度的陽(yáng)性核酸稀釋液作6次重復(fù)檢測(cè)，得到的CT值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)

5、證該方法的重復(fù)性。
　　2.結(jié)果:
　　(1)敏感性和特異性本方法檢測(cè)CoxB1、 CoxB2、 CoxB3和其他腸道病毒靈敏度均達(dá)到103copies/ml。對(duì)CoxB1、 CoxB2、 CoxB3和腸道病毒具有較好的特異性， CoxB1、 CoxB2、 CoxB3引物探針與其他病毒如輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16等均無(wú)交叉反應(yīng)。
　　(2)重復(fù)性對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作6個(gè)重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果不

6、同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.09～0.28之間，變異系數(shù)均低于1.0％，具有較好的重復(fù)性。
　　3.結(jié)論:
　　所建立的四重?zé)晒舛縭RT-PCR法可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他未分型的腸道病毒，其檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，具有非常大的臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分四重?zé)晒舛縭RT-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒B1、B2、B3及其他腸道病毒方法的臨床應(yīng)用
　　1.方法:
　　利用所建

7、立的四重?zé)晒舛縭RT-PCR方法對(duì)所采集到的病毒性心肌炎疑似患兒535份糞便標(biāo)本和43份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并隨機(jī)選取10份陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性。
　　2.結(jié)果:
　　578份標(biāo)本共檢測(cè)到腸道病毒153份，陽(yáng)性率為26.5％(153/578)，其中CoxB1病毒69份，陽(yáng)性率為11.9％(69/578);CoxB2病毒18份，陽(yáng)性率為3.1％(18/578);CoxB3病毒27