1,25-(OH)2D3對(duì)豬成釉細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 隨著分子生物學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，目前牙齒再生已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。牙齒再生組織工程包括單純構(gòu)建和全牙重建：?jiǎn)渭儤?gòu)建是將形成牙齒某一部分的細(xì)胞與相應(yīng)支架材料復(fù)合后植入動(dòng)物體內(nèi)而成，目前此方面的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展；而全牙重建很復(fù)雜，涉及多種牙齒形成細(xì)胞的復(fù)合和不同類型支架材料的組合，這類研究進(jìn)展緩慢。牙釉質(zhì)是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最硬的組織，模擬牙釉質(zhì)的礦化過(guò)程，生產(chǎn)出具有再礦化能力的生物義齒一直是牙科醫(yī)生的夢(mèng)想。目

2、前，生物礦化形成牙釉質(zhì)的過(guò)程仍然建立在成釉細(xì)胞和蛋白質(zhì)的相互作用基礎(chǔ)上。成釉細(xì)胞是牙釉質(zhì)的形成細(xì)胞，釉原蛋白(Amelogenin，AMEL)是釉質(zhì)有機(jī)基質(zhì)的主體，AMEL對(duì)釉質(zhì)礦化的起始、晶核的形成及排列等諸多因素起著重要的調(diào)節(jié)作用。非AMEL包括釉蛋白和成釉蛋白(Ameloblastin，AMBN)等也被認(rèn)為具有較廣泛的促進(jìn)晶體成核和影響晶體生長(zhǎng)形態(tài)的作用。故任何影響成釉細(xì)胞生長(zhǎng)及其蛋白質(zhì)分泌的因素均能影響牙釉質(zhì)的礦化過(guò)程。

3、　　 1，25-(OH)2D3作為維生素D甾體類激素的活化形式，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及蛋白質(zhì)的分泌等起著重要的調(diào)控作用，其受體在口腔組織中分布廣泛，其中成釉細(xì)胞是VD的靶細(xì)胞之一。國(guó)外學(xué)者通過(guò)RT-PCR及Northern Blot等方法研究發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞所分泌的AMEL的表達(dá)受1，25-(OH)2D3調(diào)控。然而，RT-PCR及Northern Blot均是從轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)目的基因，而非翻譯水平，從轉(zhuǎn)錄水平到翻譯水平還有復(fù)雜的過(guò)程，因此基

4、因的表達(dá)量與蛋白的表達(dá)量不一定呈正相關(guān).本研究通過(guò)體外培養(yǎng)豬成釉細(xì)胞，應(yīng)用Western Blot法在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)不同濃度以及不同作用時(shí)間下的1，25-(OH)2D3對(duì)豬成釉細(xì)胞所分泌的特異性蛋白-AMEL及AMBN表達(dá)變化的影響，為牙釉質(zhì)生物礦化的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.分離培養(yǎng)豬成釉細(xì)胞，為進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 2.研究1，25-(OH)2D3在不同濃度以及不同作用時(shí)間下對(duì)

5、體外培養(yǎng)的豬成釉細(xì)胞增殖的影響。
　　 3.在翻譯水平上研究1，25-(OH)2D3在不同濃度以及不同作用時(shí)間下對(duì)體外培養(yǎng)的豬成釉細(xì)胞所分泌的特異性蛋白-AMEL及AMBN表達(dá)變化的影響。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：選擇約6月齡30kg重的西藏小型豬，無(wú)菌條件下取出磨牙牙胚，分離牙囊、牙乳頭及成釉器。將成釉器組織剪成約1mm3大小的組織塊，采用組織塊法原代培養(yǎng)，酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　 2.細(xì)

6、胞鑒定：通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行初步鑒定。采用成釉細(xì)胞特異性蛋白-AMEL抗體對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行定性。
　　 3.濃度梯度的1，25-(OH)2D3(0、1×10-10、1×10-8、1×10-6mol/L)作用于體外培養(yǎng)的豬成釉細(xì)胞，分別在加藥后1天、3天、5天，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
　　 4.濃度梯度的1，25-(OH)2D3(0、1×10-10、1×10-

7、8、1×10-6mol/L)作用于體外培養(yǎng)的豬成釉細(xì)胞，分別在加藥后1天、3天、5天，用Western免疫印跡檢測(cè)其分泌的AMEL及AMBN的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征：豬成釉細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形或多角形等，可見(jiàn)多核、絲狀偽足、鋸齒狀邊緣。部分細(xì)胞含有明顯的顆粒樣物質(zhì)，可能為星網(wǎng)層細(xì)胞。在卵圓形的上皮細(xì)胞中間可見(jiàn)大細(xì)胞樣細(xì)胞，而不像成纖維細(xì)胞(長(zhǎng)梭形，胞體較小，胞核較大，居中，核

8、仁清晰)，在培養(yǎng)過(guò)程中隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間及代數(shù)的增長(zhǎng)，大細(xì)胞樣細(xì)胞逐漸盛行且不能繼續(xù)增殖。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示細(xì)胞角蛋白-14染色胞漿呈棕黃著色，陽(yáng)性，而波形絲蛋白染色胞漿無(wú)著色，陰性，表明該細(xì)胞為上皮來(lái)源。細(xì)胞特異性抗AMEL抗體染色胞漿呈棕黃著色，陽(yáng)性，表明該細(xì)胞為成釉細(xì)胞。
　　 3.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，在同一作用時(shí)間點(diǎn)上，1，25-(OH)2D3在1×10-10～1×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)豬

9、成釉細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，其中1×10-6mol/L組作用最強(qiáng)，1×10-10mol/L組作用最弱，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間，各實(shí)驗(yàn)組之間均相差顯著(P<0.05)。在相同濃度的1，25-(OH)2D3作用下，隨作用時(shí)間的增長(zhǎng)，1，25-(OH)2D33抑制細(xì)胞增殖的作用也逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞增殖趨勢(shì)明顯減緩，各實(shí)驗(yàn)組之間均相差顯著(P<0.05)，呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 4.Western Blot檢

10、測(cè)結(jié)果顯示，在相同濃度的1，25-(OH)2D3作用下，隨作用時(shí)間的增長(zhǎng)，AMEL及AMBN的表達(dá)均增強(qiáng)，各實(shí)驗(yàn)組之間均相差顯著(P<0.05)；在同一作用時(shí)間點(diǎn)上，隨1，25-(OH)2D3濃度的升高，AMEL的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而AMBN的表達(dá)逐漸減弱。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間，各實(shí)驗(yàn)組之間均相差顯著(P<0.05)。
　　 5.豬成釉細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好，且可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持其上皮樣形態(tài)和生物學(xué)