M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3對(duì)破骨細(xì)胞形成分化影響的比較研究.pdf

1、目的：利用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系，研究M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3對(duì)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形成及分化的影響，探討三種細(xì)胞因子間相互作用及協(xié)同作用，為進(jìn)一步研究破骨細(xì)胞及合理選用細(xì)胞因子提供依據(jù)。
　　 方法：選用4周齡SD雄性大鼠（體重80-120g），利用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系，進(jìn)行體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3對(duì)破骨細(xì)胞形成及分化的影響，同時(shí)比較三種細(xì)胞因子的作用。

2、　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞因子添加：
　　 1.1 全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)：取4周齡SD雄性大鼠一只(80-120g)，異氟烷麻醉后，無菌條件下取其股骨和脛骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔，用10ml無菌注射器抽取不含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集全骨髓細(xì)胞，將所提取的細(xì)胞懸液充分吹打至沒有細(xì)胞團(tuán)塊后，置于離心機(jī)內(nèi)離心5分鐘（1500轉(zhuǎn)/分），棄去上清液，加入含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，充分吹打混勻后形成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)

3、數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞原液濃度，然后配制濃度為2×106cells/ml的細(xì)胞懸液，加入青霉素100單位/ml和鏈霉素100ug/ml。將細(xì)胞播種于24孔培養(yǎng)板（4行6列）中，每孔加入濃度為2×106cells/ml的細(xì)胞懸液0.5ml。
　　 1.2 細(xì)胞因子的添加：24孔培養(yǎng)板第一列為對(duì)照組，不添加任何藥物：第二列加入1,25-(OH)2D3(1×10-8Mol/ml);第三列加入1,25-(OH)2D3+RANKL(1

4、,25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+RANKL20ng/ml）；第四列加入1,25-(OH)2D3+M-CSF(1，25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+M-CSF20ng/ml);第五列加入1,25-(OH)2D3+M-CSF+RANKL(1,25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+M-CSF20ng/ml+RANKL20ng/ml);第六列加入RANKL+M-CSF(RANKL20ng/ml+M-CSF20

5、ng/ml)。
　　 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞因子添加完畢后將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第4天時(shí)更換培養(yǎng)液一次，共培養(yǎng)7天。
　　 2.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：培養(yǎng)至第7天后行TRAP染色，倒置光鏡下觀察，計(jì)算3核以上染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)處理采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方差分析和S-N-K檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　

6、 1.破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)前三天各組均未見破骨細(xì)胞形成，培養(yǎng)第五天開始實(shí)驗(yàn)組可見少量破骨細(xì)胞形成，培養(yǎng)至第七天實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞已經(jīng)分化成熟，而對(duì)照組始終沒有破骨細(xì)胞的形成。對(duì)全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行TRAP染色后，光鏡下可見到大量成熟的破骨細(xì)胞，其形態(tài)學(xué)特征為：細(xì)胞體積較大，呈橢圓形、漏斗形、油煎蛋樣、條索狀或不規(guī)則形。細(xì)胞漿豐富呈紫紅色，細(xì)胞核較大，數(shù)目達(dá)幾個(gè)甚至多達(dá)幾十個(gè)，核仁清晰，細(xì)胞漿內(nèi)可見空泡結(jié)構(gòu)。
　　 2.M-CSF、

7、RANKL和1,25-(OH)2D3對(duì)破骨細(xì)胞的形成和分化均具有促進(jìn)作用，多因子比單因子和雙因子在相同條件下形成的破骨細(xì)胞數(shù)目多。全骨髓培養(yǎng)系中，培養(yǎng)板第一列（對(duì)照組）沒有添加細(xì)胞因子，最終沒有破骨細(xì)胞的形成；第二列加入1,25-(OH)2D3形成了破骨細(xì)胞，證明1,25-(OH)2D3對(duì)破骨細(xì)胞的形成和分化具有促進(jìn)作用；第三列、第四列除加入1,25-(OH)2D3外，還分別加入了RANKL和M-CSF，最終都有破骨細(xì)胞的形成，并且形成

8、破骨細(xì)胞的數(shù)目較第二列多，與第二列相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)，說明RANKL和M-CSF對(duì)破骨細(xì)胞的形成和分化也具有促進(jìn)作用，但第三、四列間無顯著性差異(P＞0.05)；第五列同時(shí)加入M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3后形成的破骨細(xì)胞數(shù)目最多，說明三種細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞形成和分化具有協(xié)同促進(jìn)作用，與第二、三、四、六列比較，有顯著性差異(P＜0.05)。第六列只加入RANKL和M-CSF后也形成了破骨細(xì)胞，但數(shù)量