1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘小鼠肺內(nèi)HMGB1及TLR4表達(dá)的影響.pdf

1、支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱為哮喘）是在兒童時(shí)期發(fā)病率偏高的一種的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，多種炎癥細(xì)胞、呼吸道結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分均可參與哮喘發(fā)病的慢性炎癥過程。呼吸道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)、氣道結(jié)構(gòu)重構(gòu)一直被看作是哮喘發(fā)病過程基本的三大病理特征，其中氣道慢性炎癥一直被視為最基本的病理變化，并決定氣道高反應(yīng)性及氣道重塑的嚴(yán)重程度。哮喘的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全弄清楚，至今經(jīng)過大量試驗(yàn)研究顯示:機(jī)體自身免疫紊亂與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切，目前關(guān)于哮喘免疫紊亂研究的

2、主要方向在Th1/Th2免疫失衡所引起的一系列不正常免疫應(yīng)答，但至今哮喘Th1/Th2免疫失衡的具體機(jī)制尚未清楚。近年來兒童哮喘的發(fā)病率及死亡率逐年提高，嚴(yán)重影響兒童的健康和生活質(zhì)量。高遷移率蛋白B1(HMGB1)是普遍存在的并且高度保守的一種核蛋白，由樹突狀細(xì)胞(DC)、炎癥細(xì)胞、垂體細(xì)胞等在炎癥因子的作用下活化后主動(dòng)釋放，病理?yè)p傷過程中的壞死細(xì)胞也可釋放。HMGB1作為免疫調(diào)節(jié)因子的一種，其釋放至細(xì)胞外會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，免

3、疫細(xì)胞受到HMGB1的刺激后則可以產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)。HMGB1作為晚期炎癥因子，不但參與多種促炎細(xì)胞趨化、血管黏附分子、細(xì)胞因子等彼此互相作用引起的炎癥反應(yīng)，還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制中研究證實(shí):HMGB1可與其受體toll樣受體4(TLR4)相互作用，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，引起下游炎癥介質(zhì)釋放。1，25(OH)2D3是維生素D3(VitD3)在體內(nèi)經(jīng)修飾活化后形成的，與存在于細(xì)胞內(nèi)的維生素D受體（vitamin

4、 Dreceptor，VDR)聯(lián)結(jié)后發(fā)揮經(jīng)典的調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷代謝作用，并在影響細(xì)胞增殖、分化方向和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等方面發(fā)揮極其重要作用。研究顯示:1，25(OH)2D3是一種免疫調(diào)節(jié)劑，其調(diào)節(jié)免疫的作用主要是通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的活性來實(shí)現(xiàn)。它對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖、分化發(fā)育、細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞因子的產(chǎn)生也存在廣泛影響。
　　目前在流行病學(xué)調(diào)查中證實(shí):1，25-(OH)2D3在可影響哮喘的發(fā)病過程，但其影響哮喘發(fā)病的詳細(xì)的作

5、用途經(jīng)仍不清楚。本次試驗(yàn)方法是:通過應(yīng)用卵清蛋白致敏和霧化激發(fā)制作哮喘小鼠模型，應(yīng)用1，25-(OH)2D3腹腔注射為干預(yù)方法，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)在顯微鏡下觀察各組小鼠氣道重塑程度的變化，以及應(yīng)用PCR及免疫組化方法從RNA水平及蛋白水平觀察哮喘小鼠肺組織內(nèi)HMGB1及TLR4表達(dá)量的改變，從而深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制，為治療哮喘提供副作用小并且有效的治療方法。
　　試驗(yàn)?zāi)康模?br>　　通過應(yīng)用卵清蛋白致敏和霧化激發(fā)制作哮喘小

6、鼠氣道重塑模型成功后，應(yīng)用1，25-(OH)2D3腹腔注射為干預(yù)方法，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野(10×40)下應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)觀察各組小鼠氣道重塑程度的變化，以及應(yīng)用PCR及免疫組化方法從RNA水平及蛋白水平觀察哮喘小鼠肺組織內(nèi)HMGB1及TLR4表達(dá)量的改變，從而深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制，為治療哮喘提供副作用小及有效的治療方法。
　　試驗(yàn)材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)小鼠分組和哮喘小鼠模型制作
　　30只SPF級(jí)小

7、鼠按隨機(jī)原則分組，分為對(duì)照組、哮喘組、干預(yù)組，每組小鼠各10只，參照文獻(xiàn)制備哮喘小鼠氣道重塑動(dòng)物模型。哮喘小鼠模型的制作通過腹腔注射及霧化激發(fā)，并在每次霧化前給予1，25-(OH)2D3干預(yù)治療。
　　2.肺組織標(biāo)本的制備
　　致敏后的各組小鼠在末次霧化激發(fā)后的24小時(shí)內(nèi)取肺組織標(biāo)本，用于免疫組化和HE染色、RT-PCR操作。
　　3.HE染色
　　石蠟切片后，然后進(jìn)行HE染色操作，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野(10×

8、40)下應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)觀察各組小鼠支氣管氣道壁結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，測(cè)定不同組別小鼠同級(jí)支氣管壁厚度，并觀察各組小鼠炎癥細(xì)胞在支氣管周圍的浸潤(rùn)情況。
　　4.免疫組化染色
　　采用連續(xù)切片，每隔3張切片選取1張，每只小鼠隨機(jī)選取3張切片，在組織切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色操作。在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野(10×40)下應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)觀察測(cè)定陽性細(xì)胞中HMGB1/TLR4蛋白的表達(dá)。每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)以上高倍鏡視野

9、，取平均IOD值作為該片的蛋白半定量結(jié)果。
　　5.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)HMGB1及TLR4mRNA表達(dá)
　　用-80℃保存的新鮮小鼠肺組織行RT-PCR操作，目的基因HMGB1/TLR4mRNA的表達(dá)量以的HMGB1/TLR4的DNA條帶和GAPDH的DNA條帶灰度值的比值表示。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）來表示計(jì)量資料，多組計(jì)量資料的比較采用

10、單因素方差分析，LSD-t法用于組間數(shù)據(jù)的兩兩比較。Pearson相關(guān)分析方法用于分析兩變量的相關(guān)性，P＜0.05為兩組數(shù)據(jù)的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.各組小鼠氣道病理改變
　　在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野(10×40)下應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)觀察:對(duì)照組小鼠具有結(jié)構(gòu)平滑、規(guī)則、整齊的支氣管壁結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞無損壞、脫落，排列規(guī)整，氣道壁厚度適中，較少的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);哮喘組小鼠支氣管壁厚度增加，使支氣管腔變

11、窄，上皮細(xì)胞損壞、脫落，排列不規(guī)整，多數(shù)杯狀細(xì)胞化生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在支氣管周圍，可見大量粘液分泌;干預(yù)組氣道壁厚度、管腔狹窄、杯狀細(xì)胞化生數(shù)量、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較哮喘組減輕。各組間小鼠支氣管壁厚度相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.各組小鼠免疫組化結(jié)果
　　在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野(10×40)下應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)觀察，HMGB1蛋白主要定位在炎性細(xì)胞及組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿，TLR4主要定位

12、在炎性細(xì)胞及上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞漿。HMGB1/TLR4表達(dá)呈陽性的細(xì)胞為深棕黃色細(xì)胞。對(duì)照組小鼠弱表達(dá)HMGB1及TLR4蛋白;哮喘組小鼠表達(dá)的HMGB1及TLR4蛋白較對(duì)照組升高，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，與對(duì)照組相比，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);干預(yù)組小鼠表達(dá)的HMGB1及TLR4蛋白顯著低于哮喘組，但仍高于對(duì)照組，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義(P＜0.05)。
　　3.各組小鼠肺組織內(nèi)HMGB1/TLR4mRNA檢測(cè)結(jié)果
　　逆

13、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果顯示，HMGB1/TLR4mRNA在哮喘組小鼠肺內(nèi)的表達(dá)量比對(duì)照組明顯增高，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);干預(yù)組小鼠肺內(nèi)HMGB1/TLR4mRNA表達(dá)量比哮喘組明顯降低，較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.采用1，25-(OH)2D3對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行干預(yù)治療可明顯減輕哮喘小鼠氣道炎癥，并防止氣道重塑的產(chǎn)生。
　　2.1，25-(OH)2