miRNA-449a在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的:
　　 microRNA(miRNA)是一類長度為20～23nt的在多種真核生物中可以調(diào)控基因表達(dá)的高度保守非編碼小RNA。miRNA可以通過與一個或多個mRNA的部分序列互補而調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而影響生命活動，它的功能失調(diào)常常會引起重要過程出現(xiàn)紊亂，包括器官變化、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活等。而在腫瘤的發(fā)生過程中，不同的miRNA可能起著癌基因或者抑癌基因的作用。目前，肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其病理類型主要

2、為兩種，一是進(jìn)展性較快的小細(xì)胞癌，占總體比例的13～15％左右，二是非小細(xì)胞癌，包括腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，大細(xì)胞癌，大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌等，占總體比例的85％左右。肺癌預(yù)后較差的原因有多方面，轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者療效和生存時間的關(guān)鍵問題之一，明確的轉(zhuǎn)移機(jī)制目前仍然不清楚，因此缺乏有效的治療手段。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-449a在胃癌、膀胱癌、前列腺癌等癌癥中均有抑癌作用，而miRNA-449a對于肺癌的生物學(xué)功能影響尚不清楚，在本研究中我們試

3、圖通過對miRNA-449a在肺癌中的生物學(xué)作用進(jìn)行研究，探討肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)在機(jī)制，為提高肺癌的早期診斷、特異性治療及預(yù)后判斷水平提供新的思路，同時探索肺癌的特異性新靶標(biāo)。
　　 方法:
　　 (1)基因芯片分析:分別提取高、低不同轉(zhuǎn)移潛能人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D/95C的總RNA，應(yīng)用MicroRNA芯片技術(shù)檢測95C/95D中miRNA-449a的差異性表達(dá)水平。
　　 (2)使用real-time

4、PCR技術(shù)對差異表達(dá)的miRNA-449a進(jìn)行驗證:首先提取人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95C/95D的總RNA，然后設(shè)計miRNA-449a的反轉(zhuǎn)錄引物及上游引物和下游引物，設(shè)置內(nèi)參U6為對照，反轉(zhuǎn)錄RNA檢測miRNA-449a在95C/95D細(xì)胞株中的表達(dá)水平，同時使用瓊脂糖凝膠電泳對real-time PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　 (3)構(gòu)建過表達(dá)miRNA-449a的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-449a:首先根據(jù)miRB

5、ase數(shù)據(jù)庫確定miRNA-449a的序列，設(shè)計miRNA-449a的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行鑒定后構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-449a，通過酶切及基因測序再次鑒定。
　　 (4)建立過表達(dá)miRNA-449a的穩(wěn)定細(xì)胞株95D-pCDNA3.1-miR-449a:使用真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-449a轉(zhuǎn)染細(xì)胞株95D后應(yīng)用潮霉素進(jìn)行篩選，篩選出可穩(wěn)定過表達(dá)miR-449a的細(xì)胞株95D-p

6、CDNA3.1-miR-449a并通過real-timePCR技術(shù)進(jìn)行驗證。
　　 (5)95D-pCDNA3.1-miR-449a細(xì)胞株增殖能力檢測:設(shè)置空白對照組及陰性對照組后，使用MTT法檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-449a后95D細(xì)胞株增殖能力的變化。
　　 (6)95D-pCDNA3.1-miR-449a細(xì)胞株遷移能力檢測:設(shè)置空白對照組及陰性對照組后，使用劃痕試驗檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-449a后95D細(xì)胞株遷移能力

7、的變化。
　　 (7)95D-pCDNA3.1-miR-449a細(xì)胞株侵襲能力檢測:設(shè)置空白對照組及陰性對照組后，使用Boyden小室實驗檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-449a后95D細(xì)胞株侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)MicroRNA芯片顯示在低轉(zhuǎn)移潛能人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95C中的miRNA-449a水平明顯高于高轉(zhuǎn)移潛能人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D，real-time PCR再次證實了miRNA-449a在

8、人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95C中的水平高于人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D;
　　 (2)成功構(gòu)建能夠過表達(dá)miRNA-449a的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-449a，得到酶切和基因測序的證實后，進(jìn)一步建立了可過表達(dá)miRNA-449a的穩(wěn)定細(xì)胞株95D-pCDNA3.1-miR-449a，并通過了real-time PCR驗證;
　　 (3)MTT實驗證明過表達(dá)miRNA-449a后對95D細(xì)胞株的增殖無影響(P＞0.05

9、);劃痕試驗表明經(jīng)過48h培養(yǎng)后，95D-pCDNA3.1-miR-449a細(xì)胞株的劃痕寬度(298.3±4.382μm)明顯大于空白對照組(106.7±3.753μm)和轉(zhuǎn)染空載體組(89.1±4.017μm)(P＜0.01)，證明過表達(dá)miR-449a可以使95D細(xì)胞株遷移能力降低;Boyden小室實驗表明，95D-pCDNA3.1-miR-449a的細(xì)胞透膜數(shù)(53.79±3.972)明顯小于空白對照組(162.28±3.819)

10、和轉(zhuǎn)染空載體組(150.63±4.625)(P＜0.01)，證明過表達(dá)miR-449a可以使95D細(xì)胞株侵襲能力降低。
　　 結(jié)論:
　　 (1) miR-449a在低轉(zhuǎn)移性人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95C中的表達(dá)水平明顯高于在高轉(zhuǎn)移性人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D中的水平，提示其可能與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，有可能成為肺癌治療的目的基因。
　　 (2)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-449a，并建立了穩(wěn)定過表達(dá)miR-