MicroRNA-128在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的:肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率以及病死率最高的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病較為隱匿，惡性程度較高，很多患者就診時肺癌分期已較晚，失去了手術(shù)治療的可能性，而放化療又不能特異性的殺死癌細(xì)胞。因此，尋找新的有效的肺癌診斷治療靶點(diǎn)，研究其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對于提高肺癌患者的生存率以及改善預(yù)后具有重要的意義[1]。MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物中的長度為22～25nt高度保守非編碼的單鏈小分子RNA，它們能夠與靶基因m

2、RNA不完全性地互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與到胚胎的發(fā)育、細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程中[2]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，不同的miRNA分別起著癌基因或者抑癌基因的作用。近年來，大量研究證明miRNAs參與到了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中，比如miRNA-128在乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中均有抑癌作用，而miRNA-128對于肺癌的生物學(xué)功能影響尚不清楚[3]，因此在本研究中我們系統(tǒng)深入的研究miRNA-128對肺癌細(xì)胞

3、株的生物學(xué)功能影響，對于探索肺癌的診斷治療新靶點(diǎn)以及改善肺癌患者預(yù)后有著非比尋常的意義。
　　方法:(1)使用real-time PCR技術(shù)檢測在轉(zhuǎn)移潛能不同的細(xì)胞株中miRNA-128表達(dá)是否有差異:首先將人肺癌細(xì)胞株NL9980/L9981的總RNA提取后，設(shè)計miRNA-128的反轉(zhuǎn)錄引物以及相應(yīng)的上、下游引物，以內(nèi)參U6作為對照，反轉(zhuǎn)錄RNA以檢測miRNA-128在人肺癌細(xì)胞株NL9980/L9981中的表達(dá)水平，最后對

4、real-time PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行鑒定。(2)構(gòu)建過表達(dá)miRNA-128的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-128:首先查詢miRBase數(shù)據(jù)庫確定miRNA-128的基因序列，設(shè)計miRNA-128的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，鑒定成功后構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-128，構(gòu)建完成后使用雙酶切以及瓊脂糖凝膠電泳再次鑒定，鑒定成功后進(jìn)行基因測序檢測是否為目的基因。(3)

5、建立穩(wěn)定過表達(dá)miRNA-128的細(xì)胞株L9981-pCDNA3.1-miR-128:使用前述方法構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體 pCDNA3.1-miR-128轉(zhuǎn)染L9981細(xì)胞株后使用潮霉素首先進(jìn)行篩選，篩選出可穩(wěn)定過表達(dá)miR-128的細(xì)胞株L9981-pCDNA3.1-miR-128，并使用real-time PCR技術(shù)來檢測目的基因表達(dá)水平，以證實細(xì)胞株建立是否成功。(4)檢測L9981-pCDNA3.1-miR-128細(xì)胞株的增殖能

6、力:對穩(wěn)定過表達(dá)miR-128后的L9981細(xì)胞株使用MTT法來檢測其增殖能力是否改變，并以轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組以及未轉(zhuǎn)染載體的空白對照組作為對比。(5)檢測L9981-pCDNA3.1-miR-128細(xì)胞株的遷移能力:對穩(wěn)定過表達(dá)miR-128后的L9981細(xì)胞株使用劃痕試驗的方法來檢測其遷移能力是否改變，并以轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組以及未轉(zhuǎn)染載體的空白對照組作為對比。(6)檢測L9981-pCDNA3.1-miR-128細(xì)胞株的侵襲

7、能力:對穩(wěn)定過表達(dá)miR-128后的L9981細(xì)胞株使用Boyden小室試驗的方法來檢測其侵襲能力是否改變，并以轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組以及未轉(zhuǎn)染載體的空白對照組作為對比。
　　結(jié)果:(1)通過real-time PCR技術(shù)證實了miRNA-128在低轉(zhuǎn)移潛能的人肺癌細(xì)胞株NL9980中的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)移潛能較高的人肺癌細(xì)胞株L9981，(2)能夠穩(wěn)定過表達(dá)miRNA-128的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-128經(jīng)過雙酶

8、切、瓊脂糖凝膠電泳以及基因測序的方法證實構(gòu)建成功，進(jìn)一步使用該載體建立了能夠穩(wěn)定過表達(dá)miRNA-128的細(xì)胞株L9981-pCDNA3.1-miR-128，并使用real-time PCR技術(shù)驗證成功;(3)穩(wěn)定過表達(dá)miRNA-128的L9981細(xì)胞株經(jīng)MTT試驗證實增殖能力無改變(p＞0.05);在劃痕試驗中，細(xì)胞株L9981-pCDNA3.1-miR-128的劃痕寬度（195.1±3.819μm）明顯大于空白對照組(89.3±2

9、.592μm)以及陰性對照組(121.7±4.623μm)(p＜0.01)，證實過表達(dá)miR-128可降低L9981細(xì)胞株的遷移能力;在Boyden小室試驗中，L9981-pCDNA3.1-miR-128的細(xì)胞透膜數(shù)（37.01±2.859）明顯小于空白對照組（126.83±4.316）以及陰性對照組（93.25±4.316）(p＜0.01)，證實過表達(dá)miR-128可降低L9981細(xì)胞株的侵襲能力。
　　結(jié)論:(1)miR-12

10、8在高、低轉(zhuǎn)移潛能不同的肺癌細(xì)胞株L9981/NL9980中的差異性表達(dá)提示其與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，并且其可能發(fā)揮抑癌基因的作用。(2)穩(wěn)定過表達(dá)miR-128的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-miR-128以及穩(wěn)定過表達(dá)miR-128的L9981-pCDNA3.1-miR-128細(xì)胞株的建立成功，為研究其在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用奠定了堅實的基礎(chǔ)。(3)過表達(dá)miR-128能夠降低肺癌細(xì)胞株L9981的遷移及侵襲能力，而對增殖能力沒有影響，