K562-imatinib耐藥細胞株的建立及其生物學性狀的初步研究.pdf

1、研究目的： 1．體外建立K562/imatinib耐藥細胞株并對其生物學特性初步探討。 2．研究其可能的耐藥機制，為腫瘤耐藥的研究提供實驗室條件。 研究方法： 1．K562耐藥細胞耐藥克隆建立：以伊馬替尼(imatinib)濃度梯度遞增法誘導K562細胞耐藥。極限稀釋法克隆篩選，建立耐藥細胞株。 2．K562R的生物學特性分析：24孔板培養(yǎng)K562R和K562S，繪制細胞生長曲線。MTT法檢測不同

2、濃度組的伊馬替尼對K562S和K562R耐藥性。 3．K562R耐藥機制的初步分析：PCR．技術擴增BCR-ABL融合基因及mdrl多藥耐藥基因。測序分析ABL酪氨酸激酶區(qū)有無點突變。流式細胞術檢測P-gp表達。 研究結果： 1．KS62R的克隆純化和生物學特性分析 極限稀釋法成功克隆篩選出6株K562/imatinib純化細胞株，其能長期存活于5μmol/L的伊馬替尼培養(yǎng)液中。細胞生長曲線顯示5μmol

3、/L伊馬替尼作用于K562R細胞120h，活細胞數(shù)量與0h活細胞數(shù)量相比呈指數(shù)遞增。6個濃度梯度的伊馬替尼(0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0μmol/L)作用于K562S細胞24h，發(fā)現(xiàn)所有濃度(0濃度除外)伊馬替尼均可明顯抑制K562S細胞的生長，24h細胞活力幾乎為零。 MTT法抑制率測定K562S細胞IC50為0.67±0.09μmol/L，K562R細胞約為10.17±0.85μmol/L，耐藥倍數(shù)約為15

4、倍，細胞耐藥性明顯增加，各耐藥細胞株間IC50無顯著性差異。 2.K562R耐藥機制的初步分析 巢式PCR檢測K562R.及K562S細胞株均有1579bp及863bp大小BCR.ABL融合基因表達，863bp目的基因序列測定未發(fā)現(xiàn)點突變。 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)一株耐藥細胞mdr1表達陽性，流式細胞術檢測其P-gp弱陽性，兩者具有一致性。 結論： 1.體外成功建立K562/imatinib耐藥細胞