紫草素對IL-22介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　銀屑病(Psoriasis)是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，病情頑固，且發(fā)病率在逐年增高。該病組織病理改變主要為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)過度增殖和分化異常，真皮乳頭毛細(xì)血管增生、擴張，以及真表皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤。近年來，銀屑病發(fā)病的免疫機制備受關(guān)注，對銀屑病患者皮損處T細(xì)胞的特性及其產(chǎn)生細(xì)胞因子功能的研究發(fā)現(xiàn)，一種新的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞即Th17細(xì)胞及其活化后產(chǎn)生的細(xì)胞因子Interleukin-1

2、7A(IL-17A)、IL-17F和IL-22在銀屑病的發(fā)病中具有重要作用。一個重要發(fā)現(xiàn)是在銀屑病患者的皮損及血漿中IL-22表達均顯著增加。研究表明，IL-22阻礙KC的終末分化，誘導(dǎo)KC的促炎基因表達和KC的遷移。然而目前并不十分明確IL-22介導(dǎo)的KC效應(yīng)的細(xì)胞分子機制。Grb2-相關(guān)結(jié)合蛋白1/2(Grb2-associated binder1/2，Gab1/2)是一類腳手架/接頭蛋白，主要參與膜表面受體酪氨酸激酶和非受體酪氨酸

3、激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。磷酸化的Gab1通過與含有2個Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2)的蛋白酪氨酸磷酸酶(Src homology2 domain-containingtyrosine phosphatase，Shp-2)相互作用，具有調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的表皮生長和分化，但尚不清楚Gab1以及同樣高表達于KC細(xì)胞上的Gab2在IL-22誘導(dǎo)的KC增殖、遷移和分化中是否發(fā)揮作用？
　　銀屑病屬于中醫(yī)“白疕”、“蛇虱”、“松皮癬”等范疇。清熱

4、解毒，涼血活血是中醫(yī)治療本病的重要治則。紫草味甘、咸，性寒，有涼血、活血、清熱、解毒透疹等功效。紫草素(Shikonin)為紫草中的主要有效成分之一，具有多種藥用價值，包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)靜、清熱解毒、免疫調(diào)節(jié)以及促進傷口愈合等。在對紫草素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機制的研究中發(fā)現(xiàn)，紫草素可調(diào)節(jié)促分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-ativatedprotein kinase kinase，MAPK)通路的活性，降低Erk，Jn

5、k，Stat3磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖、存活。臨床發(fā)現(xiàn)紫草素治療銀屑病具有較好的療效，但其機制尚有待探討。我們提出一假設(shè)，即紫草素通過拮抗IL-22刺激皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞引起的Gab1/2的磷酸化，進一步抑制其下游Erk/MAPK信號通路的活化，從而抑制KC增殖，影響KC分化及遷移等。
　　本文的研究目的:
　　第一部分:研究紫草素對IL-22刺激HaCaT細(xì)胞生物學(xué)行為影響
　　1.觀察紫草素對IL-22

6、刺激HaCaT細(xì)胞增殖、遷移的影響;
　　2.觀察紫草素對IL-22刺激HaCaT細(xì)胞分泌S100A7，S100A8、S100A9的影響。
　　第二部分:紫草素對IL-22刺激HaCaT細(xì)胞生物學(xué)行為改變的機制研究
　　1.研究IL-22刺激HaCaT細(xì)胞中Jak1/Tyk2/Stat，Erk/MAPK信號通路中相關(guān)蛋白表達;
　　2.研究IL-22刺激Gab1和Gab2突變體（Shp2結(jié)合缺陷型）感染的HaCa

7、T細(xì)胞中Erk/MAPK信號通路中相關(guān)蛋白表達;
　　3.研究IL-22刺激Gab1和Gab2基因沉默的HaCaT細(xì)胞中Erk/MAPK信號通路中相關(guān)蛋白表達;
　　4.探討Gab1和Gab2是否共同參與IL-22誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移以及對細(xì)胞分化的影響;
　　5.研究IL-22刺激HaCaT細(xì)胞后Gab1、Gab2以及Erk1/2磷酸化水平及紫草素干預(yù)后的變化。
　　研究方法:
　　1.WST-1法檢測細(xì)

8、胞增殖;
　　2.Transwell法檢測細(xì)胞遷移;
　　3.Real-TimePCR法檢測基因mRNA表達;
　　4.Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達;
　　5.免疫沉淀技術(shù)檢測特定蛋白間的相互作用;
　　6.構(gòu)建Shp2結(jié)合缺陷型Gab1和/或Gab2以及Gab1和Gab2 siRNA干擾的重組腺病毒;
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05時差異有

9、統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.紫草素抑制HaCaT細(xì)胞的生長
　　不同濃度的紫草素對HaCaT細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，但低濃度時（濃度為0.1和0.25μg/ml），紫草素本身不影響細(xì)胞活性，對HaCaT細(xì)胞無損傷及毒性作用。
　　2.紫草素抑制IL-22介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖和遷移
　　實驗分組:未處理（未加紫草素和IL-22）組、IL-22刺激24h組、IL-22+紫草素24h組， IL-

10、22刺激48h組、IL-22+紫草素48h組。紫草素作用濃度選擇為0.25μg/ml，IL-22推薦工作濃度為100ng/ml，IL-22刺激HaCaT細(xì)胞24h和48h后可促進細(xì)胞增殖和遷移，與未處理組相比，P均＜0.05;加入紫草素組，IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖和遷移作用被抑制，P均＜0.05。
　　3.紫草素可下調(diào)IL-22誘導(dǎo)的促炎癥因子S100A7、S100A8mRNA表達
　　Real-Time PCR檢

11、測紫草素對IL-22刺激HaCaT細(xì)胞分泌促炎癥因子S100A7、S100A8，S100A9mRNA影響，根據(jù)擴增曲線由公式得出2-△Ct值（即實驗組目的基因的表達相對于對照組基因的變化倍數(shù)），IL-22刺激S100A7 S100A8mRNA表達與未處理組相比其差別倍數(shù)（2-△△Ct）均大于2，而加入紫草素組與IL-22組相比其差別倍數(shù)均小于1，表明IL-22可明顯刺激HaCaT細(xì)胞分泌S100A7，S100A8，而紫草素可下調(diào)IL-2

12、2誘導(dǎo)的S100A7S100A8mRNA表達，但對S100A9mRNA的影響不明顯。
　　4.IL-22誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞Jak1/Tyk2/Stat通路、MAPK通路的活化
　　HaCaT細(xì)胞饑餓處理16-18h后，加入IL-22(100ng/ml)刺激10min、20min、30min、60min以及120min，提取總蛋白，Western blot檢測到IL-22刺激10min后即可見Jak1/Tyk2/Stat通路中

13、Stat3Tyr705位酪氨酸磷酸化、Stat3Ser727位絲氨酸磷酸化、Jak1以及Tyk2磷酸化;MAPK通路中Erk1/2和p38磷酸化。Mek抑制劑PD98059(10μM)預(yù)處理HaCaT細(xì)胞1h，然后再用IL-22刺激，則Erk1/2活化被抑制，同時PD98059預(yù)處理后IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的增殖及遷移亦被抑制（P分別＜0.01和＜0.05），而KC細(xì)胞分化標(biāo)志性蛋白Loricrm在IL-22刺激72h后仍未檢測

14、到表達，但PD98059預(yù)處理后再用IL-22刺激則Loricrin表達明顯增加。
　　5.IL-22刺激HaCaT細(xì)胞引起Gab1和Gab2磷酸化，并進一步活化Erk1/2
　　IL-22刺激饑餓處理后的HaCaT細(xì)胞，10min后裂解細(xì)胞，采用免疫共沉淀技術(shù)及免疫印跡技術(shù)檢測IL-22刺激后，Gab1和Gab2磷酸化水平明顯升高，Shp2結(jié)合增強。以表達Shp2結(jié)合缺陷型Gab1和Gab2重組腺病毒(AdGab1FF、A

15、dGab2F)以及野生型Gab1和Gab重組腺病毒(AdGab1 WT、AdGab2 WT)感染HaCaT,檢測IL-22刺激引起的Erk1/2以及Stat3 Tyr795蛋白活化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Erk1/2磷酸化水平在(AdGab1FF)HaCaT、(AdGab2F)HaCaT組明顯降低，Stat3 Tyr795磷酸化水平在缺陷型組及野生型組基本沒有變化;IL-22刺激siRNA沉默Gab1和/或Gab2腺病毒感染的HaCaT細(xì)胞(A

16、dGab1 siRNA)HaCaT、(AdGab2siRNA) HaCaT、(AdGab1siRNA+AdGab2siRNA) HaCaT，檢測Erk1/2以及Stat3 Tyr795蛋白活化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Erk1/2磷酸化水平在基因沉默組中明顯降低，磷酸化Stat3 Tyr795水平依然沒有變化。
　　6.Gab1和Gab2影響IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及分化與Shp2相關(guān)
　　IL-22刺激(AdGa

17、b1WT)HaCaT、(AdGab2 WT)HaCaT、(AdGab1FF)HaCaT、(AdGab2F)HaCaT，24h和48h后分別檢測細(xì)胞增殖率及細(xì)胞遷移，結(jié)果(AdGab1FF)HaCaT、(AdGab2F)HaCaT組細(xì)胞增殖率減低（P均＜0.01），遷移細(xì)胞數(shù)減少（P均＜0.01）;IL-22刺激(AdGab1siRNA) HaCaT、(AdGab2siRNA) HaCaT、(AdGab1 siRNA+AdGab2siRN

18、A)HaCaT，24h和48h后檢測細(xì)胞增殖率和遷移，與感染空載體HaCaT細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖率減低(P＜0.05，P＜0.01)，細(xì)胞遷移數(shù)減少（P均＜0.05）。IL-22刺激重組腺病毒感染的HaCaT的細(xì)胞72h后，檢測Loricin蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型組相比，基因突變和沉默組細(xì)胞Loricin的表達量均明顯增加。
　　7.紫草素拮抗IL-22刺激皮膚角質(zhì)細(xì)胞引起的Gab1，Gab2以及Erk1/2的磷酸化

19、　　IL-22刺激經(jīng)紫草素(0.25μg/ml)預(yù)處理HaCaT細(xì)胞，檢測Gab1和Gab2以及Erk1/2磷酸化水平，與未經(jīng)紫草素處理組相比，明顯減低。
　　研究結(jié)論:
　　1.紫草素能夠抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的增殖和遷移，并下調(diào)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞S100A7，S100A8 mRNA表達。
　　2.IL-22誘導(dǎo)Jak1/Tyk2/Stat及MAPK通路在HaCaT細(xì)胞中的活化，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、

20、遷移和分化。
　　3.Gab1和Gab2共同參與IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中的Erk/MAPK信號通路的活化，并共同參與IL-22介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和分化。Shp2與Gab1和Gab2結(jié)合是IL-22介導(dǎo)的效應(yīng)所必需的。
　　4.紫草素抑制IL-22誘導(dǎo)的Gab1，Gab2以及Erk1/2磷酸化，從而推論紫草素治療銀屑病機制可能與抑制IL-22引起的Gab1、Gab2磷酸化，進一步抑制Erk1/2-MAPK通路活化有關(guān)