Trop2調(diào)控頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性的分子機制研究.pdf

1、頭頸鱗癌的早期轉(zhuǎn)移及對化療藥物不敏感一直是影響患者療效的重要原因，因此尋找頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移和化療增敏有關(guān)的關(guān)鍵分子及其分子機制一直是人們研究的重點和熱點。本文將分章討論一新穎分子-腫瘤相關(guān)鈣離子信號轉(zhuǎn)導因子2(Trop2)對頭頸鱗癌細胞轉(zhuǎn)移及其對化療敏感性的作用及其調(diào)控的分子機制。
　　 第一章 Trop2在頭頸鱗癌中的異常表達及其臨床意義
　　 目的：分別在RNA水平和蛋白水平探討頭頸鱗癌組織中Trop2的表達與腫瘤T分期

2、、臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學參數(shù)的關(guān)系，并檢測。Trop2在頭頸鱗癌細胞系中的表達水平。
　　 方法：采用熒光定量PCR方法檢測53例頭頸鱗癌組織、25例癌旁組織的新鮮標本；采用免疫組織化學的方法檢測87例頭頸鱗癌組織、20例癌旁組織的石蠟組織標本，分析其在頭頸鱗癌組織中的表達與臨床病理學參數(shù)的關(guān)系。采用Western blot實驗方法檢測Trop2在頭頸鱗癌細胞系中的表達。SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分

3、析。
　　 結(jié)果：
　　 1)Trop2 mRNA在頭頸鱗癌組織中相對表達量明顯高于癌旁組織中的表達量(P<0.001)，Trop2 mRNA的過表達表達與頭頸腫瘤的臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)(P<0.001)，而與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　 2)Trop2蛋白在頭頸鱗癌組織中的表達強度明顯高于癌旁粘膜組織(P<0.01)，Trop2蛋白的過表達與頭頸腫瘤的臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等

4、因素相關(guān)(P<0.01)，而與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　 3)Trop2蛋白在頭頸鱗癌細胞株中的表達量由高到低依次為Tu686>M4>M2>Hep2>Tu212。
　　 結(jié)論：以上結(jié)果提示檢測Trop2的表達與頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，為頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移和化療增敏機制的研究提供了新的線索。
　　 第二章構(gòu)建沉默Trop2的shRNA的質(zhì)粒載體和建立Trop2-shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株

5、>　　 目的：利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建針對Trop2基因的shRNA質(zhì)粒載體Trop2-shRNA，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA的細胞株。
　　 方法：使用pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/RNAi載體構(gòu)建表達shRNA對Trop2基因的RNA干擾的質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的Trop2-shRNA及對照no-targe-shRNA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染高表達Trop2的M4和Tu686細胞，通過熒光定量PCR、W

6、estern blot及CCK-8法檢測效果。篩選出有效質(zhì)粒后，應(yīng)用G418篩選轉(zhuǎn)染細胞，建立穩(wěn)定沉默Trop2基因的M4和Tu686細胞株。
　　 結(jié)果：
　　 1)經(jīng)過質(zhì)粒DNA測序，pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/RNAi(1、2、3號)構(gòu)建成功。
　　 2)瞬時轉(zhuǎn)染后檢測顯示TACSTD2-RNAi-3質(zhì)粒為RNA干擾效果最強的質(zhì)粒。其在Tu686與M4細胞Trop2 mRNA沉默效率分

7、別為56.4％和52.7％，在Tu686與M4細胞Trop2蛋白沉默率分別為49.7％和45.0％。該質(zhì)粒對Tu686與M4細胞的生長抑制率分別為27.84±4.15％和25.08±3.73％。
　　 3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TACSTD2-RNAi-3質(zhì)粒后，在Tu686與M4細胞Trop2 mRNA沉默效率分別為81.5％和76.2％，Trop2蛋白沉默率分別為75.7％和72.8％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了沉默Trop2的sh

8、RNA的質(zhì)粒載體和建立Trop2-shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Tu686與M4細胞株，為后續(xù)的實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章沉默Trop2基因?qū)︻^頸鱗癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及可能機制的探討
　　 目的：探討沉默Trop2基因后，頭頸腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因表達的改變
　　 方法：CCK-8法檢測沉默Trop2基因后對Tu686細胞生長增殖的影響，Transwell細胞侵襲試驗與細胞劃痕

9、試驗分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA質(zhì)粒的Tu686細胞及其對照細胞。Western blot檢測實驗組和對照組細胞中E-Cadherin與β-catanin表達的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA質(zhì)粒的Tu686細胞在24、48、72小時的細胞抑制率明顯高于對照組，分別為14.3±2.1％，28.7±3.6％、35.4±3.4％，對照組細胞在24、48、72小時的抑制率分別為3.3±1

10、.4％、5.7±1.3％、4.8±1.1％(P<0.001)。
　　 2)細胞劃痕試驗顯示Trop2-shRNA Tu686細胞在48小時遷移細胞數(shù)為39±7.7，明顯低于對照組no-target-shRNA Tu686細胞68±17.4，細胞遷移降低率為42.6％(P<0.01)。
　　 3)Transwell細胞侵襲試驗顯示Trop2-shRNA Tu686細胞侵襲數(shù)為153±20.6，明顯低于對照組no-targe

11、t-shRNA Tu686細胞侵襲數(shù)247±36.4，侵襲能力降低為38.1％(P<0.01)。
　　 4)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)沉默Trop2基因后能同時增強E-Cadherin的表達，然而，β=catenin的表達無明顯改變。
　　 結(jié)論：沉默Trop2的表達能減弱頭頸鱗癌細胞的生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，Trop2可能對EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin的表達起到了調(diào)控作用。4
　　 第四章沉默Tro

12、p2基因?qū)︻^頸鱗癌細胞化療敏感性的影響
　　 目的：探討沉默Trop2基因后，頭頸鱗癌細胞化療敏感性的改變
　　 方法：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA質(zhì)粒的Tu686和M4細胞及其對照細胞均予以不同濃度梯度的紫杉醇或順鉑處理48小時后，使用CCK-8法檢測細胞生長增殖情況。使用IC30的藥物濃度處理Tu686和M4細胞，24小時后，使用Tunnel法和AnnexinⅤ法檢測細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　

13、 1)紫杉醇作用后Trop2-shRNA tu686細胞的細胞存活率明顯低于對照組 no-target-shRNA tu686細胞，實驗組IC50值(9.931±0.876)×10-8明顯低于對照組的IC50值(9.484±0.744)×10-7(P<0.001)。
　　 2)紫杉醇作用后Trop2-shRNA M4細胞的細胞存活率明顯低于對照組no-target-shRNA M4細胞，實驗組IC50值(1.959±0.017

14、6)×10-7明顯低于對照組的IC50值(1.396±0.174)×10-6(P<0.001)。
　　 3)順鉑作用后，實驗組與對照組tu686細胞及M4細胞的細胞存活率無明顯差異。(P>0.05)。
　　 4)紫杉醇作用后，Tunnel檢測法顯示Trop2-shRNA tu686細胞凋亡比例為44.3±3.4％，明顯高于對照組細胞凋亡比例28.7±2.6％(P<0.01)。AnnexinⅤ流式細胞檢測法顯示Trop2-

15、shRNAtu686細胞凋亡比例為31.39±2.83％，明顯高于對照組細胞凋亡比例14.67±2.77％(P<0.01)。
　　 5)紫杉醇作用后，Tunnel檢測法顯示Trop2-shRNA M4細胞凋亡比例為42.8±4.6％，明顯高于對照組細胞凋亡比例27.9±3.1％(P<0.01)。AnnexinⅤ流式細胞檢測法顯示Trop2-shRNAM4細胞凋亡比例為33.75±3.47％，明顯高于對照組細胞凋亡比例14.72±