P53 binding protein1調(diào)控乳腺癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移及化療敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的最常見惡性腫瘤之一。全球乳腺癌的發(fā)病率以每年0.2～8％的幅度上升，每年約有140萬(wàn)人被診斷為乳腺癌，約50萬(wàn)人死于乳腺癌。我國(guó)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年遞增的趨勢(shì)，并且發(fā)病年齡趨向于年輕化。乳腺癌的生存率與臨床分期密切相關(guān)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移往往是乳腺癌的致死因素。Macià等研究顯示乳腺癌的5年生存率為83.3％，其中Ⅰ期患者5年生存率達(dá)97.1％，而Ⅳ期患者僅為2

2、4.5％。乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中往往伴隨著一系列原癌基因的激活及抑癌基因的失活，這些分子生物學(xué)的異常決定著腫瘤的特征，也是其臨床進(jìn)展行為的基礎(chǔ)。越來(lái)越多的基因已被證實(shí)與乳腺癌的進(jìn)展轉(zhuǎn)移相關(guān)，如人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）、Metadherin(MTDH)等原癌基因以及P53、BRCA1等抑癌基因，并且部分基因已經(jīng)作為分子靶向治療的位點(diǎn)應(yīng)用到乳腺癌的臨床治療中。因此，發(fā)現(xiàn)決定乳腺癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移和化療耐藥的關(guān)鍵基因?qū)⒂兄趶姆肿铀缴?/p>

3、認(rèn)識(shí)乳腺癌，并對(duì)其早期診斷和分子靶向治療的新藥研發(fā)具有極其重要的意義。
　　P53bindingprotein1(53BP1)是DNA損傷信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要基因，53BP1缺失的細(xì)胞對(duì)DNA損傷敏感，其缺失可以增強(qiáng)放療敏感性已經(jīng)被充分證實(shí)。在導(dǎo)師與國(guó)際多家研究機(jī)構(gòu)的研究中，通過(guò)分析了176例乳腺癌患者53BP1基因rs560191位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)rs560191位點(diǎn)GG基因型與局部高復(fù)發(fā)率密切相關(guān);通過(guò)對(duì)504例平均有7

4、.5年隨訪結(jié)果的乳腺癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，約15％的患者表現(xiàn)為53BP1蛋白缺失，而且其缺失與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。我們這些前期結(jié)果均支持53BP1是乳腺癌中一個(gè)有重要功能的抑癌基因，但其在乳腺癌中的作用卻知之甚少。
　　研究方法及結(jié)果:
　　在本課題中，我們擬進(jìn)一步深入研究53BP1基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，具體內(nèi)容包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分53BP1調(diào)控乳腺癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　

5、研究方法:為了驗(yàn)證53BP1的在乳腺癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先借助WesternBlot技術(shù)檢測(cè)了39對(duì)新鮮乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁正常乳腺組織中53BP1的表達(dá)情況，并對(duì)316例乳腺癌發(fā)生過(guò)程中（乳腺正常組織→不典型增生→原位癌→浸潤(rùn)癌）53BP1的表達(dá)量進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，從而驗(yàn)證53BP1在乳腺癌的發(fā)生過(guò)程中起到重要的作用。
　　隨后我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)53BP1的3個(gè)干擾序列，并將其連接到干擾載體pGPU6-Neo-GFP上

6、，然后通過(guò)公司測(cè)序驗(yàn)證干擾載體的成功構(gòu)建。53BP1的過(guò)表達(dá)載體N-Myc-53BP1WTpLPC-Puro為美國(guó)洛克菲勒大學(xué)TitiadeLange教授贈(zèng)與。我們將53BP1的干擾載體(shRNA)和過(guò)表達(dá)載體（53BP1-OVE）及對(duì)照載體(Control)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7等，分別加入G418和嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)53BP1及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞系，并用Real-timeP

7、CR和WesternBlot驗(yàn)證53BP1干擾和過(guò)表達(dá)的效果。
　　為了檢測(cè)53BP1對(duì)乳腺癌增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響，我們首先用MTT和平板克隆形成的方法分別檢測(cè)干擾53BP1對(duì)MCF-7和T47D、過(guò)表達(dá)53BP1對(duì)MDA-MB-231和MDA-MB-468的增殖和克隆形成的影響，接著用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)53BP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力的影響。為了闡明其具體的分子機(jī)制，我們將轉(zhuǎn)染53BP1前后的細(xì)胞系，送全基因組mic

8、roRNA表達(dá)譜芯片，篩選出變化最顯著的microRNA-146a。通過(guò)文獻(xiàn)檢索和借助miRbase、PicTar和TargetScan等數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)microRNA-146a的靶基因?yàn)閜65，進(jìn)一步用WesternBlot檢測(cè)53BP1干擾或過(guò)表達(dá)前后對(duì)NF-kappaB通路的影響。隨后對(duì)過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行microRNA-146asiRNA的轉(zhuǎn)染，觀察NF-kappaB通路的變化，并分析53BP1對(duì)增殖和浸

9、潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響。為了進(jìn)一步證實(shí)53BP1對(duì)乳腺癌增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響，我們通過(guò)裸鼠皮下成瘤模型，觀察過(guò)表達(dá)53BP1前后對(duì)裸鼠皮下成瘤能力和生長(zhǎng)速度的影響，并對(duì)皮下成瘤的組織應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和WesternBlot檢測(cè)NF-kappaB通路的變化;通過(guò)尾靜脈注射的肺轉(zhuǎn)移模型觀察過(guò)表達(dá)53BP1前后對(duì)肺轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　研究結(jié)果:臨床研究中，我們通過(guò)WesternBlot檢測(cè)新鮮乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁正常乳腺組織中53BP1

10、的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)53BP1在癌組織中的表達(dá)量明顯低于其配對(duì)的正常組織。通過(guò)對(duì)316例乳腺癌不同發(fā)生階段中的組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示53BP1在96.00％的正常乳腺(Normal)組織中表達(dá)(48/50，)、在乳腺普通增生(UDH)的組織中表達(dá)率也高達(dá)90.32％(28/31)、在乳腺不典型增生(ADH)的組織中表達(dá)率為64.71％(11/17)、在導(dǎo)管內(nèi)原位癌(DCIS)組織中的表達(dá)率僅為45％(9/29)、而在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(C

11、ancer)的組織中53BP1的表達(dá)率僅為16.40％(31/189)(p＜0.05)。
　　細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證53BP1的干擾載體pGPU6-Neo-GFP53BP1shRNA和過(guò)表達(dá)載體N-Myc-53BP1WTpLPC-Puro的正確性，并在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體，并標(biāo)記為53BP1-OVE;在MCF-7和T47D細(xì)胞中轉(zhuǎn)染干擾載體并標(biāo)記為shRNA，并通過(guò)Realt

12、imePCR和WesternBlot驗(yàn)證了53BP1的干擾或過(guò)表達(dá)效果良好，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　首先我們檢測(cè)了53BP1對(duì)乳腺癌增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響。MTT和平板克隆形成顯示干擾53BP1的MCF-7和T47D細(xì)胞增殖速度加快(MCF-7，P=0.048;T47D，P=0.073)、克隆形成能力明顯增強(qiáng)(MCF-7，P=0.007;T47D，P=0.008)，過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231和MDA-MB-468的增殖速

13、度明顯降低（MDA-MB-231，P=0.089;MDA-MB-468，P=0.061）、克隆形成能力明顯下降（MDA-MB-231，P=0.006;MDA-MB-468，P=0.002）。Transwell結(jié)果顯示干擾53BP1的MCF-7和T47D細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低、過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)（P均小于0.0001）。為了研究其具體的分子機(jī)制，通過(guò)對(duì)53BP1干擾和

14、過(guò)表達(dá)前后的細(xì)胞送全基因組microRNA表達(dá)譜芯片和Real-timePCR驗(yàn)證，顯示microRNA-146a為變化最顯著的microRNA。我們通過(guò)WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)53BP1干擾后可激活NF-kappaB通路，誘導(dǎo)P65的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，而過(guò)表達(dá)53BP1后則抑制了此通路。隨后我們對(duì)過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行microRNA-146asiRNA的轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)53BP1對(duì)NF-kappaB通路的抑

15、制作用，并能逆轉(zhuǎn)53BP1對(duì)增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響。通過(guò)裸鼠皮下成瘤觀察干擾或過(guò)表達(dá)53BP1前后對(duì)裸鼠皮下成瘤能力和生長(zhǎng)速度的影響，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)53BP1后能明顯抑制腫瘤的成瘤能力和生長(zhǎng)速速(P＜0.001)，并且與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)53BP1的腫瘤邊界比較清晰，這提示過(guò)表達(dá)53BP1能抑制腫瘤的侵襲能力;通過(guò)對(duì)皮下成瘤的組織用免疫組織化學(xué)染色和WesternBlot檢測(cè)NF-kappaB通路的變化，也進(jìn)一步驗(yàn)證了體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

16、通過(guò)對(duì)尾靜脈注射的肺轉(zhuǎn)移模型觀察過(guò)表達(dá)53BP1前后對(duì)肺轉(zhuǎn)移能力的影響，我們發(fā)現(xiàn)注射對(duì)照組及過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞5周后，對(duì)照組的11只裸鼠的肺組織肉眼和顯微鏡下均能發(fā)現(xiàn)明顯的較大轉(zhuǎn)移灶，而過(guò)表達(dá)53BP1組的僅在顯微鏡下能看到較小的轉(zhuǎn)移灶。
　　第二部分53BP1抑制乳腺癌血管形成的機(jī)制研究
　　研究方法:為了檢測(cè)53BP1對(duì)乳腺癌血管新生的影響，我們通過(guò)收集正常傳代培養(yǎng)的干擾或過(guò)表達(dá)53BP1的乳腺癌

17、細(xì)胞的上清，分別通過(guò)毛細(xì)血管形成實(shí)驗(yàn)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞觀察53BP1對(duì)小管形成能力的影響;通過(guò)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)血管新生的能力的影響;通過(guò)主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)作用于小鼠主動(dòng)脈環(huán)觀察新生血管數(shù)目的變化。并選取83例乳腺癌組織進(jìn)行新生血管標(biāo)記物CD31、MMP-2和MMP-9免疫組化染色分析53BP1在臨床乳腺癌組織中與血管形成的關(guān)系。為了闡明53BP1影響血管新生的機(jī)制，在干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞中應(yīng)用Akt的siRNA

18、后，通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn)、主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)和CAM實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Akt是否參與了53BP1影響乳腺癌血管新生的影響。并通過(guò)對(duì)裸鼠皮下成瘤的組織進(jìn)行CD31的免疫組織化學(xué)染色體內(nèi)驗(yàn)證53BP1對(duì)血管形成的影響。
　　研究結(jié)果:通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞能明顯增加其小管形成能力，而過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞明顯抑制其成管能力（MCF-7，P=0.026;MDA-MB-231，P=0.004）。通過(guò)雞胚絨毛

19、尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞能明顯增加血管新生能力，而過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞明顯抑制其能力（MCF-7，P=0.025;MDA-MB-231，P=0.006）。通過(guò)主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)作用于小鼠主動(dòng)脈環(huán)觀察新生血管分支變化，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞能明顯增加新生血管分支的形成而過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞明顯抑制新生血管分支的形成能力（MCF-7，P=0.002;M

20、DA-MB-231，P=0.008）。為了闡明53BP1影響血管新生的機(jī)制，我們用WesternBlot篩選出Akt通路，并在干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AktsiRNA后，通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn)、主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)和CAM實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Akt降低后可逆轉(zhuǎn)干擾53BP1后對(duì)乳腺癌血管新生的促進(jìn)作用。我們進(jìn)一步借助體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證53BP1對(duì)血管新生的影響，通過(guò)對(duì)裸鼠皮下成瘤的組織進(jìn)行CD31的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞形成的

21、腫瘤中微血管密度的標(biāo)記物CD31數(shù)量明顯增多(11.2±4.3vs.27.3±5.9;P＜0.001)而過(guò)表達(dá)53BP1的MDA-MB-231細(xì)胞形成的腫瘤中CD31數(shù)量減少(21.4±7.8vs.5.1±3.7;P＜0.001)。臨床研究中我們通過(guò)選取83例乳腺癌組織進(jìn)行新生血管標(biāo)記物CD31、MMP-2和MMP-9免疫組化染色，結(jié)果顯示53BP1的高表達(dá)與CD31、MMP-2、MMP-9的低表達(dá)密切相關(guān)(P=0.012、P=0.03

22、7、P=0.003)，這進(jìn)一步證實(shí)了53BP1對(duì)血管新生的影響。
　　第三部分53BP1增強(qiáng)乳腺癌對(duì)5-氟尿嘧啶敏感性的機(jī)制研究
　　研究方法:為了檢測(cè)53BP1對(duì)乳腺癌化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性的影響，我們首先用MTT檢測(cè)了不同乳腺癌細(xì)胞中53BP1的表達(dá)量與5-Fu的敏感性的關(guān)系，用免疫熒光法檢測(cè)了5-Fu處理各個(gè)乳腺癌細(xì)胞系后53BP1和H2AX的定位。接下來(lái)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了5-Fu處理53BP1干擾或

23、過(guò)表達(dá)前后對(duì)細(xì)胞周期的影響，用WesternBlot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Akt、Bcl-2、Bax、P21的變化。為了探討53BP1影響5-Fu的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染前后胸苷酸合成酶(TS)和二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)的變化，并在干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞中用TS和DPYD的siRNA驗(yàn)證53BP1對(duì)5-Fu的影響。同時(shí)通過(guò)裸鼠皮下成瘤模型，對(duì)單獨(dú)或同時(shí)轉(zhuǎn)染53BP1和應(yīng)用5-Fu處理后裸鼠成瘤能力和腫瘤生長(zhǎng)速度的影響，并對(duì)成瘤的組

24、織用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　研究結(jié)果:通過(guò)MTT檢測(cè)顯示乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和T47D中53BP1的表達(dá)量越高，其對(duì)5-Fu的反應(yīng)越敏感，通過(guò)用免疫熒光法檢測(cè)5-Fu處理乳腺癌細(xì)胞系后53BP1和H2AX的定位也證實(shí)了此結(jié)果。通過(guò)對(duì)干擾或過(guò)表達(dá)53BP1的細(xì)胞用MTT檢測(cè)其對(duì)5-Fu的敏感性，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)53BP1可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感

25、性，而干擾53BP1的細(xì)胞則表現(xiàn)出對(duì)5-Fu的耐藥性。接下來(lái)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)53BP1干擾或過(guò)表達(dá)前后細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)53BP1可誘導(dǎo)G2/M期的阻滯，用WesternBlot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示53BP1可增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax和P21、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。通過(guò)WesternBlot檢測(cè)顯示干擾53BP1后TS和DPYD升高而過(guò)表達(dá)53BP1后二者均降低。通過(guò)在干擾53BP1的MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TS和DPYD的si

26、RNA發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)干擾53BP1后對(duì)5-Fu的耐藥性。體內(nèi)試驗(yàn)，通過(guò)裸鼠皮下成瘤模型，對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)染53BP1和同時(shí)應(yīng)用5-Fu處理后裸鼠成瘤能力和腫瘤生長(zhǎng)速度的影響，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1后的腫瘤呈現(xiàn)出對(duì)5-Fu的耐藥性，而過(guò)表達(dá)53BP1的腫瘤能明顯增強(qiáng)5-Fu對(duì)腫瘤的抑制作用，并且聯(lián)合應(yīng)用過(guò)表達(dá)53BP1和5-Fu后要明顯優(yōu)于過(guò)表達(dá)53BP1或者5-Fu的單一作用。體內(nèi)試驗(yàn)通過(guò)對(duì)皮下成瘤的組織用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)5

27、3BP1過(guò)表達(dá)的并用5-Fu處理的MDA-MB-231形成的腫瘤中細(xì)胞凋亡明顯多于對(duì)照組，干擾了53BP1的MCF-7且用5-Fu處理的腫瘤中凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了干擾53BP1能抑制5-Fu誘導(dǎo)的凋亡而過(guò)表達(dá)53BP1能增強(qiáng)5-Fu誘導(dǎo)的凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了53BP1對(duì)乳腺癌增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、血管新生的抑制作用及增強(qiáng)化療敏感性功能。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明53BP1對(duì)乳腺

28、癌增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、血管新生的抑制作用及增強(qiáng)化療敏感性功能。
　　3.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明53BP1可通過(guò)microRNA介導(dǎo)的NF-kappaB通路影響乳腺癌的增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力;通過(guò)Akt影響血管新生的能力;通過(guò)TS和DPYD影響對(duì)化療藥物5-Fu的敏感性。
　　4.臨床研究驗(yàn)證體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)所見，進(jìn)一步支持了53BP1是一個(gè)多功能的抑癌基因。
　　意義:
　　1.揭示了53BP1抑制乳腺癌增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及血管新生的作用