EphA2調(diào)控鼻咽癌紫杉醇化療敏感性及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種鼻咽上皮來(lái)源惡性腫瘤，流行于我國(guó)南方多省。目前NPC的治療以放療為主，化療是最主要的輔助治療方法。盡管放、化療技術(shù)不斷改進(jìn)，但是NPC患者的療效仍改善不明顯。其中NPC細(xì)胞對(duì)化療抵抗性的產(chǎn)生是影響NPC療效的重要原因之一。因此尋找與NPC發(fā)生、發(fā)展及化療敏感性密切相關(guān)的基因，通過(guò)對(duì)該類有效基因的檢測(cè)和靶向調(diào)控，可以達(dá)到輔助診斷NPC、增加NPC的化療敏感性、改善NP

2、C的療效、提高NPC患者的生存率等目的，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2(erythropoietin-producinghepatocellular receptor EphA2)在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)惡性生物學(xué)行為。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)EphA2的研究多集中在其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，而

3、EphA2對(duì)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的調(diào)控國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。紫杉醇為鼻咽癌常用化療藥物，靶向調(diào)控其化療敏感性有助于提高NPC的療效。本研究將分以下三個(gè)階段探討EphA2在NPC生長(zhǎng)、增殖、侵襲過(guò)程中的作用，并重點(diǎn)研究EphA2對(duì)NPC紫杉醇化療敏感性的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　 第一章 EphA2在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的:檢測(cè)EphA2在NPC組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平，探討EphA2的表達(dá)與NPC臨床病理特征的

4、相關(guān)性。
　　 方法:利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)47例NPC新鮮組織標(biāo)本和21例鼻咽非腫瘤新鮮組織標(biāo)本以及NPC細(xì)胞株中EphA2蛋白的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析EphA2的表達(dá)與NPC臨床病理特征的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:EphA2蛋白在NPC組織中的表達(dá)較鼻咽非腫瘤組織中的表達(dá)明顯升高，在NPC細(xì)胞株中也呈現(xiàn)高表達(dá)，且EphA2蛋白的表達(dá)水平與NPC的T分級(jí)(P=0.028)、臨床分期(P=0.004)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

5、移(P=0.012)密切相關(guān)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:EphA2蛋白在NPC組織和細(xì)胞中表達(dá)升高，EphA2蛋白的表達(dá)與NPC患者的T分級(jí)、臨床分期以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示EphA2在NPC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能具有重要作用。
　　 第二章沉默和上調(diào)EphA2的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及侵襲能力的影響
　　 目的:觀察調(diào)控EphA2的表達(dá)對(duì)NPC細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周

6、期及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。
　　 方法:利用慢病毒載體介導(dǎo)的EphA2 shRNA(EphA2 shRNA-LV)和EphA2基因過(guò)表達(dá)克隆(EphA2 cDNA-LV)轉(zhuǎn)染NPC5-8F細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)EphA2蛋白的細(xì)胞系，Western Blot驗(yàn)證EphA2蛋白沉默和上調(diào)效果。CCK-8法分別檢測(cè)EphA2沉默和過(guò)表達(dá)前后細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)EphA2沉默和過(guò)表達(dá)前后細(xì)胞的

7、凋亡率及細(xì)胞周期，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EphA2沉默后細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　 結(jié)果:1.慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾和過(guò)表達(dá)克隆技術(shù)成功沉默和上調(diào)NPC5-8F細(xì)胞中EphA2的表達(dá)，并建立了穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)EphA2的細(xì)胞系。
　　 2.沉默EphA2蛋白的表達(dá)減弱5-8F細(xì)胞的體外增殖能力，72h開始EphA2沉默組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);上調(diào)EphA2蛋白的表達(dá)增強(qiáng)5-8F細(xì)

8、胞的體外增殖能力，72h始EphA2上調(diào)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3.EphA2沉默組與對(duì)照組比較，G0/G1期細(xì)胞比例(％)(沉默組:74.38±3.71 VS對(duì)照組:53.82±2.19)明顯增加，而S期細(xì)胞比例（沉默組:17.89±2.21 VS對(duì)照組:30.41±1.55）和G2/M期細(xì)胞比例（沉默組:7.72±2.24 VS對(duì)照組:15.80±3.72）則顯著降低，組間差異

9、均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。上調(diào)EphA2表達(dá)，G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯降低（上調(diào)組47.39±3.75 VS53.89±2.22），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而S期細(xì)胞比例（38.80±7.11 VS38.63±4.15）無(wú)明顯差異(P＞0.05)，G2/M期細(xì)胞比例則較對(duì)照組增加（14.15±3.00VS7.81±2.36），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。沉默EphA2的表達(dá)，細(xì)胞的凋亡率(％)較對(duì)照組

10、無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而EphA2過(guò)表達(dá)細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組減少（4.94±1.45 VS8.99±0.84），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.沉默EphA2的表達(dá)，5-8F細(xì)胞的體外侵襲能力較對(duì)照組明顯減弱(穿過(guò)小室到下室面的細(xì)胞數(shù):沉默組:59±4 VS對(duì)照組:103±12)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:EphA2通過(guò)影響NPC細(xì)胞的周期進(jìn)展調(diào)控其體外增殖能力，并能影響

11、NPC細(xì)胞的體外侵襲能力，提示EphA2在NPC的發(fā)展和惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 第三章 EphA2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇化療敏感性的調(diào)控作用及其分子機(jī)制
　　 目的:探討EphA2對(duì)NPC細(xì)胞紫杉醇化療敏感性的影響及其分子機(jī)制。
　　 方法:基因過(guò)表達(dá)克隆EphA2 cDNA和EphA2 vector質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞，72h后Western Blot技術(shù)檢測(cè)EphA2的表達(dá)水平。梯度濃度紫杉醇分別

12、作用于穩(wěn)定沉默EphA2表達(dá)的5-8FEphA2-RNAi+細(xì)胞及5-8F細(xì)胞和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)EphA2表達(dá)的5-8FEphA2 cDNA+細(xì)胞、5-8FEphA2 vector細(xì)胞及5-8F細(xì)胞，48h后CCK-8法檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算各組細(xì)胞生存率和紫杉醇IC50濃度。IC30濃度紫杉醇分別作用于5-8F EphA2 cDNA+細(xì)胞、5-8FEphA2 vector組及5-8F細(xì)胞，48h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)

13、胞周期，Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中EphA2、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(CDK2、Cyclin E、p21、p27、Rb和p-Rb)和PI3-K/Akt信號(hào)通路蛋白(Akt、p-Akt、GSK-3β、 p-GSK-3β)的表達(dá)水平。以20nM、10nM和0nM濃度的PI3-K/Akt抑制劑LY294002分別處理5-8FEphA2 c DNA+細(xì)胞后，再予以梯度濃度紫杉醇處理，48h后CCK-8法檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，計(jì)算各

14、濃度抑制劑處理組細(xì)胞生存率，繪制細(xì)胞生存曲線，得出紫杉醇的IC30后，再以IC30的紫杉醇作用于以20nM、10nM和0nM濃度的PI3-K/Akt抑制劑LY294002處理過(guò)的5-8FEphA2cDNA+細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)各組EphA2、PI3-K/Akt信號(hào)通路蛋白和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡率的變化。
　　 結(jié)果:1.基因過(guò)表達(dá)克隆EphA2 cDNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)

15、胞，成功上調(diào)EphA2的表達(dá)，并建立了EphA2過(guò)表達(dá)的5-8F瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　 2.紫杉醇作用于5-8FEphA2 RNAi+細(xì)胞和5-8F細(xì)胞的IC50值分別為1.6nM和5.6nM，5-8FEphA2 RNAi+細(xì)胞對(duì)紫杉醇作用的敏感性較5-8F細(xì)胞明顯增加(P＜0.05);紫杉醇作用于5-8FEphA2 cDNA+、5-8FEphA2 vector及5-8F細(xì)胞，各組紫杉醇的IC50值分別為5nM、0.7nM、0.6n

16、M，5-8FEphA2 cDNA+細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性較5-8FEphA2 vector及5-8F細(xì)胞明顯降低(P＜0.05)。
　　 3.IC30紫杉醇作用于5-8FEphA2 cDNA+細(xì)胞、5-8FEphA2 vector細(xì)胞及5-8F細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)各組凋亡率(％)分別為:9.84±2.08、8.66±1.59、7.74±1.34，兩兩比較，差異均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5-8FEphA2cDNA+組細(xì)胞較5

17、-8Fvector組和5-8F組G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少（分別為45.25±3.89VS65.85±2.28、64.52±3.31），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而S期細(xì)胞比例（分別為31.56±1.59 VS25.76±1.89、24.55±3.64）和G2/M期細(xì)胞比例（分別為23.10±4.55VS8.39±0.81、10.94±3.27）則明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5-8Fvector細(xì)胞與5-8

18、F細(xì)胞比較，各周期細(xì)胞比例無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.EphA2的過(guò)表達(dá)，可以抑制紫杉醇作用后的5-8F細(xì)胞中周期進(jìn)展阻滯蛋白p21和p27的表達(dá);引起細(xì)胞周期抑制蛋白R(shí)b的表達(dá)活化、p-Rb表達(dá)水平增高;同時(shí)可以引起5-8F細(xì)胞中p-Akt表達(dá)上調(diào)，而Akt的表達(dá)總量不變，但是對(duì)細(xì)胞周期啟動(dòng)蛋白CDK2和CyclinE蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 5.PI3-K/Akt抑制劑LY294002可以抑制A

19、kt和GSK-3β的磷酸化導(dǎo)致p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)下調(diào)，但是Akt和GSK-3β的表達(dá)總量不變;同時(shí)細(xì)胞周期進(jìn)展阻滯蛋白p21和p27的表達(dá)升高，而促細(xì)胞周期進(jìn)展蛋白p-Rb的表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞周期啟動(dòng)蛋白CDK2和Cyclin E的表達(dá)無(wú)明顯改變。20nM、10nM和0nM濃度的PI3-K/Akt抑制劑LY294002處理IC30濃度紫杉醇干預(yù)的5-8FEphA2 cDNA+細(xì)胞，20nM和10nM抑制劑處理組細(xì)胞凋亡率

20、分別為:9.55±0.84和9.92±2.13，較不加抑制劑(0nM)組細(xì)胞凋亡率（11.67±2.30）低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);20nM和10nM抑制劑處理組G0/G1期細(xì)胞比例分別為:65.69±2.78、58.61±2.13，較不加抑制劑(0nM)組G0/G1期細(xì)胞比例（46.62±1.77）明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而S期細(xì)胞（20nM組:24.37±3.70，10nM組:27.08±2.19，

21、0nM組:32.14±1.98）和G2/M期細(xì)胞（20nM組:9.94±3.97，10nM組:14.31±1.61，0nM組:21.24±1.47）則明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PI3-K/Akt抑制劑LY294002使5-8FEphA2 cDNA+細(xì)胞對(duì)紫杉醇作用的敏感性增加。
　　 結(jié)論:EphA2通過(guò)PI3-K/Akt/GSK-3β介導(dǎo)的信號(hào)通路影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控NPC細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療的敏