載脂蛋白A5基因克隆表達(dá)及載脂蛋白A5與糖尿病血脂異常關(guān)系的研究.pdf

1、第一章重組人載脂蛋白A5原核表達(dá)載體的構(gòu)建及分析鑒定 目的：構(gòu)建重組人載脂蛋白A5（apoA5）原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，為進(jìn)一步制備抗apoA5的單/多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。 方法：從人肝癌組織中抽提總RNA，以此為模板，逆轉(zhuǎn)錄降度PCR擴(kuò)增載脂蛋白A5編碼區(qū)基因全長，構(gòu)建含有目的片斷的克隆載體pPCR-Script ampSK（+）-apoA5及原核表達(dá)載體pET16B-apoA5，并通過酶切、測序及誘導(dǎo)表達(dá)等驗(yàn)證

2、重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達(dá)量，Ni-NTA柱親和純化重組蛋白，梯度透析復(fù)性目的蛋白。 結(jié)果：成功構(gòu)建apoA5的克隆載體pPCR-Script ampSK（+）-apoA5和原核表達(dá)載體pET16B-apoA5，用第一對引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒，片段大小與PCR產(chǎn)物結(jié)果相符。由測序結(jié)果得知，人apoA5編碼區(qū)cDNA片段按設(shè)計(jì)完整、準(zhǔn)確地裝入pET16B中，保證了目的蛋白表達(dá)的正確性。1mmol/L異丙基硫

3、基-b-D-半乳糖苷（IPTG）、31℃誘導(dǎo)4h，經(jīng)SDS-PAGE電泳可見43KDa處有目的條帶。計(jì)算機(jī)處理，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的30％，純化復(fù)性后，目的蛋白濃度可達(dá)3μg/μl。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組人載脂蛋白A5原核表達(dá)載體，大腸桿菌成功表達(dá)重組蛋白apoA5。 第二章載脂蛋白A5多克隆抗體的制備與臨床應(yīng)用 目的：制備高效特異的載脂蛋白A5（apoA5）多克隆抗體，利用該抗體檢測高血脂患者血清apoA5活

4、性水平，建立定量檢測血清apoA5 ELISA法。 方法：將純化后的His-apoA5融合蛋白，免疫新西蘭大白兔，制備抗apoA5多抗。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)（ELISA）、Western印記、Dot-blot等方法進(jìn)行鑒定。同時(shí)收集不同TG濃度血清標(biāo)本初步用于臨床分析檢測。 結(jié)果： 1．ELISA方法測定多抗效價(jià)，所得抗體效價(jià)為1：104，可用于對抗原進(jìn)行檢測。中和抑制實(shí)驗(yàn)表明，隨著apoA5抗原濃度的增加，P

5、VDF膜上的蛋白條帶顏色漸弱，與所加入的中和抗原的濃度成反比，說明抑制有效，提示該抗體是特異性的針對apoA5抗原。 2．以制備的抗apoA5兔血清作一抗，進(jìn)行Western印記檢測，結(jié)果顯示，純化的重組蛋白、正常血脂者血清及正常血脂者肝臟裂解液均出現(xiàn)了特異反應(yīng)條帶，而在脾、腎、腸的混合裂解液中未見有反應(yīng)條帶，表明所制備的抗體與apoA5特異結(jié)合。 2．Dot-blot結(jié)果表明自制的apoA5多抗可以檢測重組蛋白和血清中

6、天然的apoA5蛋白，與無關(guān)蛋白不反應(yīng)。加入待測血清越多，斑點(diǎn)面積越大越深。純化的重組apoA5蛋白和正常血脂者血清的斑點(diǎn)圖均比高TG者血清的斑點(diǎn)圖濃，進(jìn)一步說明apoA5與TG的負(fù)相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論：本研究利用新西蘭大白兔制備了抗apoA5多克隆抗體，Western印記和Dot印記均表明自制的多抗特異性高，可以檢測重組蛋白和血清中天然的apoA5蛋白，為高甘油三酯血癥和冠心病的預(yù)防、診斷、治療及致病機(jī)理的研究提供新的思路和理論依

7、據(jù)。 第三章糖尿病患者血清載脂蛋白A5檢測的臨床應(yīng)用 目的：檢測糖尿病患者血清載脂蛋白A5（apoA5）水平，探討apoA5與血脂及糖尿病的相關(guān)性。 方法：收集Ⅱ型糖尿病233例，健康體檢者200例，留取血清標(biāo)本用于血糖（GLU）、膽固醇（CH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、脂蛋白a（Lp（a））、載脂蛋白AⅠ（apoAⅠ）、載脂蛋白B（apoB）的檢測，血清apoA

8、5水平的檢測采用本實(shí)驗(yàn)室建立的雙抗體夾心ELISA法，檢測抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備。 結(jié)果： 1．a(chǎn)poA5、Lp（a）與糖尿病的關(guān)系糖尿病組女性血清Glu、TG、Lp（a）及apoA5高于男性，均明顯高于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．應(yīng)用百分位數(shù)法（P2．5～P97．5）計(jì)算apoA5參考范圍為255．92～563．51μg/L。 3．糖尿病組與對照組比較，血清Tch、TG、LDL-c及ApoB明顯增高，而

9、HDL-C、apoAⅠ及apoAⅠ/apoB低于對照組，組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．a(chǎn)poA5與血脂各指標(biāo)相關(guān)性在本研究病例組中，血清apoA5水平與Glu、Lp（a）呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為：-0．40、-0．24，差異有顯著性，血清apoA5與TG、TC僅存在負(fù)相關(guān)的趨勢（r=-0．14，r=-0．07），但是沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中女性，血清apoA5水平與TG呈負(fù)相關(guān)（r=-0．41），男性和糖尿病總體中僅存在負(fù)相關(guān)趨勢