缺氧與缺氧誘導(dǎo)的自噬調(diào)控對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　 研究缺氧對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞HIF-2α表達(dá)，細(xì)胞增殖、凋亡及自噬等生物學(xué)特性的影響以及探討自噬在細(xì)胞缺氧中的作用。
　　 方法：
　　 ①通過缺氧培養(yǎng)建立人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的缺氧模型，觀察缺氧對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；缺氧培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞12h、24h、48h作為實(shí)驗(yàn)組(檢測(cè)HIF-2α蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組為缺氧培養(yǎng)腸癌HCT116細(xì)胞6h，12h、24h、4

2、8h)，常氧培養(yǎng)48h作為對(duì)照組(MTT實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組為常氧培養(yǎng)12h、24h、48h)；缺氧培養(yǎng)后，采用MTT法測(cè)定缺氧培養(yǎng)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用；應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；應(yīng)用免疫印跡Western Blot方法檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)及自噬特異性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain

3、3，LC3）的表達(dá)；②缺氧培養(yǎng)條件下利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）特異性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自噬24h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)LC3蛋白白勺表達(dá)，觀察細(xì)胞自噬抑制情況；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)JC-1法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體膜電位的變化；應(yīng)用Annexin V-PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　 ①缺氧培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞后結(jié)腸癌

4、細(xì)胞增殖明顯受到抑制，12h、24h、48h的抑制率分別為23.53％±2.93%、38.47%±1.39%、50.94%±1.17%；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示缺氧培養(yǎng)12h、24h、48h后G1期比例從常氧狀態(tài)下的54.65%逐漸升高到74.80%，而S期則從常氧狀態(tài)下的39.65%逐漸降低到12.46%，缺氧組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說明隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活力明顯受到抑制；Western Blo

5、t檢測(cè)結(jié)果顯示常氧狀態(tài)，HIF-2α表達(dá)量很少，而缺氧6h時(shí)HIF-2α即有明顯的的增加，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，HIF-2α的表達(dá)持續(xù)升高，缺氧48h后仍維持在較高水平；LC3的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，缺氧48h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值由常氧狀態(tài)下的0.263±1.67%升高到0.79±1.47%(P＜0.05)，表明缺氧明顯上調(diào)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的自噬水平；②缺氧培養(yǎng)條件下利用自噬抑

6、制劑3-MA特異性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自噬24h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞顯示，缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞24h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，表現(xiàn)為細(xì)胞離散，皺縮，而應(yīng)用3-MA抑制自噬時(shí)此種現(xiàn)象更為明顯；Western Blot檢測(cè)LC3的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中顯示，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，說明3-MA明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的實(shí)驗(yàn)中顯示缺氧培養(yǎng)條件下抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自噬24h時(shí)，綠色熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞的比值明顯低于其他各組(