miRNa-429對(duì)人乳腺癌Bcap37細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控及相關(guān)研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　乳腺癌是一種異質(zhì)性的疾病，居女性腫瘤相關(guān)死亡率第二位，包括了大量各種不同的臨床特征。在過(guò)去的十年中，大量研究證實(shí)乳腺癌可分為多個(gè)分子亞型:luminalA亞型、luminal B亞型、HER2過(guò)表達(dá)亞型、基底細(xì)胞樣亞型和正常細(xì)胞樣亞型或更多分子亞型。其中，Luminal亞型的基因表達(dá)主要與雌激素受體(ER)和/或孕激素受體(PR)陽(yáng)性的表達(dá)相關(guān);HER2過(guò)表達(dá)亞型表現(xiàn)為HER2受體的過(guò)表達(dá)以及鄰近基因17q

2、12-21的擴(kuò)增;基底樣亞型是由基底/肌上皮標(biāo)記表達(dá)來(lái)定義且普遍缺乏ER、PR和HER2的表達(dá)。重要的是，不同分子亞型有特定的mRNA表達(dá)譜，這些特定的mRNA表達(dá)譜部分歸因于不同的miRNA的表達(dá)。有研究通過(guò)將乳腺癌與癌旁組織進(jìn)行對(duì)比，揭示了乳腺癌組織中miRNA失調(diào)的普遍模式，提示了在乳腺癌的發(fā)展中miRNA失調(diào)的重要性。miR-429屬于一個(gè)miRNA家族，該家族包括miR-200c、 miR-141、miR-200b和miR-2

3、00a。miR-429在生物體內(nèi)發(fā)揮著正常的生物學(xué)功能，特異性地表達(dá)于人類胚胎干細(xì)胞中，但同時(shí)其異常表達(dá)也參與影響腫瘤干細(xì)胞和各種腫瘤的功能，但其在乳腺癌中的表達(dá)情況及功能情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌Bcap37細(xì)胞系中miR-429的表達(dá)低，進(jìn)一步的研究表明miR-429的過(guò)表達(dá)促進(jìn)人乳腺癌Bcap37細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
　　二、研究方法
　　1.利用Realtime-PCR探針?lè)z

4、測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系BT20、BT474、Bcap37、SK-BR-3、MCF7、T-47D和MDA-MB-231中miR-429的表達(dá)情況，從中選擇出miR-429表達(dá)最低的細(xì)胞系;
　　2.通過(guò)hsa-miR-429過(guò)表達(dá)慢病毒和對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染Bcap37乳腺癌細(xì)胞，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-429的人乳腺癌細(xì)胞系Bcap37及其對(duì)照細(xì)胞系;
　　3.利用RT-PCR探針?lè)z測(cè)過(guò)表達(dá)miR-429的人乳腺癌細(xì)胞系Bcap37及其對(duì)

5、照細(xì)胞系中miR-429的表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染效率;
　　4.穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-429的人乳腺癌細(xì)胞系Bcap37及其對(duì)照細(xì)胞系分別采用MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法觀察表達(dá)miR-429后對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系Bcap37增殖、遷移、轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)特性的影響;
　　5.利用Realtime-PCR探針?lè)z測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-429的人乳腺癌細(xì)胞系Bcap37及其對(duì)照細(xì)胞系對(duì)Shp2、FBXW11、GLI3、RA

6、P1B、CSNK1G3、MAP3K5、MAP4K3、PPM1B等基因相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　三、研究結(jié)果
　　1.利用Realtime-PCR探針?lè)z測(cè)結(jié)果顯示:miR-429在乳腺癌細(xì)胞系都有不同程度表達(dá)，BT20和T47D細(xì)胞系表達(dá)量最高，BT474、SK-BR-3、MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞系表達(dá)量相當(dāng)，而miR-429在Bcap37細(xì)胞中表達(dá)量最低;
　　2.將hsa-miR-429過(guò)表達(dá)慢病

7、毒感染人乳腺癌Bcap37細(xì)胞，經(jīng)篩選后得到hsa-miR-429過(guò)表達(dá)Bcap37穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。利用Realtime-PCR探針?lè)z測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，hsa-miR-429過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)Bcap37細(xì)胞株中miR-429的表達(dá)水平顯著增加;
　　3.MTT法檢測(cè)MiR-429過(guò)表達(dá)處理對(duì)細(xì)胞增值的影響。培養(yǎng)24h、48h、72h后，Bcap37細(xì)胞過(guò)表達(dá)MiR-429組的在490nm處的吸光度均明顯高于與對(duì)照組，說(shuō)明miR-4

8、29能顯著促進(jìn)Bcap37細(xì)胞的增殖;
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比， hsa-miR-429過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)Bcap37細(xì)胞株的遷移能力顯著增強(qiáng);Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)得到與上述類似的結(jié)果;
　　5.乳腺癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的差異:hsa-miR-429過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)Bcap37細(xì)胞株中Shp2的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，而FBXW11、GLI3、RAP1B、CSNK1 G3、MAP3K5、MAP4K3、PPM1B等基因相關(guān)m

9、RNA轉(zhuǎn)錄水平均低于對(duì)照組。
　　四、結(jié)論
　　目前研究表明，miRNA與家族性乳腺癌、雌激素相關(guān)受體、HER2、乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及相關(guān)化學(xué)治療耐藥等密切相關(guān)。本研究旨在研究miR-429對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-429探究了miR-429對(duì)人乳腺癌Bcap37細(xì)胞功能的影響。與之前的大多數(shù)研究基本一致，發(fā)現(xiàn)miR-429上調(diào)后能顯著促進(jìn)人乳腺癌Bcap37細(xì)胞的增殖;同時(shí)與對(duì)照的細(xì)胞相比，無(wú)論是劃痕