Annexin Ⅱ在多發(fā)性骨髓瘤及其他血液腫瘤中的表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、Annexins蛋白是一類受Ca2+調(diào)節(jié)、能夠與帶負(fù)電荷的膜磷脂結(jié)合的蛋白家族，在許多原核和真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)。Annexin II(AnxA2，A2)作為Annexin家族的重要成員，于1979年被Rade和Martin首先發(fā)現(xiàn)。AnxA2多表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和胞外均有表達(dá)。AnxA2蛋白在細(xì)胞內(nèi)以單體和異四聚體兩種形式存在。AnxA2單體由保守的C端和可變的N端組成，可與蛋

2、白質(zhì)配體P11蛋白(又名S100A10)形成異四聚體，執(zhí)行其與生物膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的一系列功能。 AnxA2蛋白參與了眾多生物學(xué)活動(dòng)，在細(xì)胞膜構(gòu)架的形成，膜聚合、內(nèi)吞和胞吐，纖溶系統(tǒng)的穩(wěn)定等生理活動(dòng)中均扮演重要角色。AnxA2還參與某些病理過程，與心血管疾病、血液病、感染、腫瘤等多種疾病相關(guān)。無論在胞內(nèi)還是胞外，AnxA2都具有廣泛的功能，對(duì)其的研究也受到越來越多的關(guān)注。 一、AnxA2單抗的制備及功能研究 研究表明

3、AnxA2的胞外區(qū)是t-PA和plasminagen的共受體，在纖溶活性的誘導(dǎo)過程中起重要作用，并是多種病毒、炎癥介質(zhì)的受體，在病毒感染，炎癥活動(dòng)中起一定作用，因此，制備針對(duì)AnxA2的胞外區(qū)的單克隆抗體對(duì)研究AnxA2在各種生理病理狀態(tài)下的功能具有重要意義。 利用本科室已經(jīng)建立起來的雜交瘤技術(shù)，將重組AnxA2蛋白經(jīng)次氮基三乙酸鎳瓊脂糖(Ni-NTAagarose)柱純化濃縮后免疫Balb/c小鼠，尾靜脈加強(qiáng)后取脾細(xì)胞融合，E

4、LISA法篩選陽性克隆，制備腹水。運(yùn)用Western blot對(duì)抗體進(jìn)行鑒定觀察抗體與原核重組蛋白反應(yīng)情況。結(jié)果可以看出：小鼠脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合后篩選獲得兩株持續(xù)分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為SZ-135，SZ-136。該株雜交瘤細(xì)胞單克隆后接種小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，腹水經(jīng)蛋白G-Sephrose4B親和層析柱純化。SZ-135，SZ-136單抗能特異性識(shí)別相對(duì)分子量為36kD的重組蛋白。同時(shí)SZ-135可以有效抑制HMEC-1體外的血

5、管形成。 二、AnxA2在多發(fā)性骨髓瘤及各類血液病中的異常表達(dá)及機(jī)制研究 1．AnxA2在多發(fā)性骨髓瘤及各類血液病中的異常表達(dá) AnxA2表達(dá)異常與人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在多種類型的腫瘤中都可觀察到AnxA2的表達(dá)異常。國外近年的研究表明，AnxA2在APL細(xì)胞膜表面的高表達(dá)與其原發(fā)性纖溶亢進(jìn)有關(guān)，但在MM及其它類型的血液病中的表達(dá)卻少有報(bào)道。 在實(shí)驗(yàn)中，通過應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了6例骨髓瘤病人和6

6、例正常人漿細(xì)胞表面AnxA2表達(dá)，明確了骨髓瘤病人漿細(xì)胞表面AnxA2表達(dá)明顯高于正常人。通過real-time PCR、Western blot、流式細(xì)胞儀檢測(cè)U266和NB4、RPMI8226、XG7、Jurkat、Rajli、12937、K562共8類血液病細(xì)胞株AnxA2表達(dá)，明確了骨髓瘤細(xì)胞株U266在mRNA、總蛋白、膜表面蛋白不同水平均較其它血液病細(xì)胞株高表達(dá)AnxA2。骨髓瘤細(xì)胞株RPM18226在總蛋白水平亦高表達(dá)An

7、xA2。 2．AnxA2基因?qū)撬枇鯱266、RPMI8226細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲力及細(xì)胞因子的影響 為了了解AnxA2基因?qū)撬枇鯱266、RPMI8226細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲力及細(xì)胞因子的影響，應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行研究。首先，采用siRNA轉(zhuǎn)染人骨髓瘤U266、RPMI8226細(xì)胞，應(yīng)用real-time PCR、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)鑒定干擾效果。繼而應(yīng)用MTT法檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞增殖的作用，應(yīng)用A

8、nnexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用Transwell板檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)對(duì)血管新生、凋亡、侵襲等相關(guān)基因的影響。結(jié)果表明，AnxA2siRNA轉(zhuǎn)染U266和RPMI8226細(xì)胞均對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，明顯降低細(xì)胞侵襲力，同時(shí)降低血管新生相關(guān)因子VEGF-C、VEGF-R2，侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-2的表達(dá)。

9、由此認(rèn)為：siRNA沉默AnxA2基因可抑制U266和RPMI8226細(xì)胞增殖、侵襲，誘導(dǎo)凋亡增加，降低血管新生、侵襲相關(guān)因子的表達(dá)。 三、各類藥物對(duì)血液病細(xì)胞株AnxA2表達(dá)的影響 1．AnxA2與沙利度胺、地塞米松誘導(dǎo)骨髓瘤病人血栓形成的相關(guān)性 為了了解沙利度胺(thalidomide)、地塞米松(DXM)在體外對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞株RPMI8226、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC-1、人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株E

10、AHY926中AnxA2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，探討AnxA2基因與沙利度胺、地塞米松誘發(fā)骨髓瘤病人血栓形成的相關(guān)性。在體外培養(yǎng)上述細(xì)胞，real time PCR檢測(cè)在不同濃度下沙利度胺及地塞米松對(duì)三種細(xì)胞株AnxA2基因表達(dá)的影響，流式細(xì)胞儀、激光共聚焦檢測(cè)對(duì)三種細(xì)胞株膜表面AnxA2蛋白表達(dá)的影響，細(xì)胞促纖溶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)三種細(xì)胞株膜表面纖溶酶活性的影響。結(jié)果表明，12．5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml沙利度胺，2．5μg

11、/ml地塞米松，25μg/ml沙利度胺加2．5μg/ml地塞米松均能誘導(dǎo)RPMI8226、HMEC-1、Eahy926細(xì)胞株AnxA2mRNA和蛋白表達(dá)下降。AnxA2抗體、12．5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml沙利度胺，2．5μg/ml地塞米松，25μg/ml沙利度胺加2．5μg/ml地塞米松均能誘導(dǎo)RPMI8226、HMEC-1、Eahy926細(xì)胞株纖溶活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故認(rèn)為，沙利度胺和地塞米松能抑制RPMI

12、8226、HMEC-1、Eahy926細(xì)胞株AnxA2mRNA和蛋白表達(dá)。由于AnxA2為t-PA和PLA的共受體，具促纖溶作用，沙利度胺和地塞米松通過下調(diào)AnxA2，抗纖溶，可能為其誘發(fā)MM血栓形成的原因之一。 2．AS2O3通過下調(diào)AnxA2抑制NB4細(xì)胞侵襲力 為了研究三氧化二砷(AS2O3)是否可通過下調(diào)AnxA2抑制人急性早幼粒白血病細(xì)胞(NB4)侵襲力的作用。在體外培養(yǎng)NB4細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度

13、AS2O3對(duì)NB4細(xì)胞膜表面AnxA2蛋白表達(dá)的影響，Transwell板檢測(cè)AnxA2抗體和AS2O3對(duì)NB4細(xì)胞侵襲力的影響。結(jié)果表明AS2O3在0．31μg/ml，0．63μg/ml，1．25μg/ml濃度均能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞膜表面AnxA2蛋白水平表達(dá)下降，存在劑量依賴性；AnxA2抗體在0．01μg/ml，0．02μg/ml，0．04μg/ml濃度和AS2O3在0．31μg/ml，0．63μg/ml，1．25μg/ml濃度均抑制