原卟啉原Ⅸ氧化酶及其機制的計算化學研究.pdf

1、原卟啉原Ⅸ氧化酶(PPO)催化氧化原卟啉原Ⅸ成為原卟啉Ⅸ，廣泛存在于動物、植物、真菌和細菌中，是生物體內葉綠素和亞鐵血紅素合成途徑中的一個關鍵酶。
　　在人體中，PPO的缺損會造成顯性遺傳疾病混合型卟啉癥(VariegatedPorphyria，VP)。目前，VP患者的數(shù)量和發(fā)病地域在不斷擴大。同時，PPO也被利用于光動力學對于癌癥的治療，因此對PPO的研究具有重要的醫(yī)學意義。植物體內的PPO的活性被抑制劑所抑制會導致綠色植物組織

2、的干枯與白化，最終使得植物死亡，因而PPO是一大類除草劑的作用靶標。因PPO非植物所特有，考慮到人畜及環(huán)境安全，種屬選擇性是針對該靶標設計、開發(fā)除草劑的關鍵問題。而且，開發(fā)抗PPO抑制劑除草劑的轉基因作物，能夠減少農藥的使用，降低農業(yè)生產成本，具有重大的經濟價值。因此對PPO的研究具有重要農學意義。另外，PPO是植物光信號轉導過程中的重要因子;PPO的多底物特性、催化底物的電子轉移功能，也使得底物的結合與催化機制的研究非常具有研究價值。

3、
　　鑒于PPO在生物體內的重要性，以及在醫(yī)學和農學上的應用，本文選擇了PPO作為主要的研究對象。在本論文中我們主要進行了以下五方面的工作:
　　一、多種屬的PPO生物信息學研究。通過對小同種屬的PPO的序列和結構的比較，識別了PPO活性位點保守殘基和差異殘基，揭示導致不同種屬PPO在細胞內的定位方式與聚集狀態(tài)差異的序列因素和結構因素，從原子水平上認識了不同種屬對抑制劑選擇性及天然抗性的序列因素和結構因素，為選擇性抑制劑的設

4、計提供最直接的信息。
　　二、PPO與底物相互作用的研究。運用計算化學中分子對接、分子動力學模擬等方法，系統(tǒng)研究了底物在三個種屬PPO（煙草線粒體、枯草芽孢桿菌和人體）中的結合方式，為PPO催化機制的研究提供了結構基礎，也為進一步的定點突變實驗提供了指導。
　　三、PPO功能的計算結構生物學的研究。結合定點突變實驗、結構生物學研究和分子動力學模擬，識別出人體PPO和枯草芽孢桿菌PPO中，對于PPO活性的保持有重要作用的極性作

5、用網絡。發(fā)現(xiàn)這個極性作用網絡通過穩(wěn)定FAD的異咯嗪環(huán)的結合環(huán)境，進而穩(wěn)定底物與FAD之間的相互作用以維持酶的催化活性。另外，還對人體PPO活性空腔的殘基功能進行定義，闡述了這些殘基對于底物與PPO的結合的貢獻。這些結果為進一步改造PPO，利用PPO發(fā)展抗除草劑轉基因作物提供了關鍵信息。
　　四、卟啉癥分子致病機制的研究。結合分子動力學模擬和統(tǒng)計學方法，闡釋了PPO致病突變體酶功能的喪失與平衡態(tài)構象的關系，通過引入定量描述PPO平衡

6、態(tài)構象的參數(shù)——優(yōu)勢構象概率，建立了預測PPO催化活性的方法（Prezyme），并準確預測了44個卟啉癥突變體的催化活性，闡述了其分子致病機制。該方法也對不同種屬PPO的催化活性有較好的預測。
　　五、PPO與抑制劑相互作用的研究。我們獲取了人體PPO與兩個二苯醚類抑制劑除草劑，乙氧氟草醚和氟磺胺草醚復合物的晶體結構，其分辨率分別為2.3(A)和2.0(A)。針對抑制劑三氟羧草醚對于煙草線粒體PPO、人體PPO和枯草芽孢桿菌PPO

7、抑制活性的差異進行了計算研究。我們發(fā)現(xiàn)，煙草PPO中的Phe392、Leu372、Leu356、Phe353和Arg98等殘基是抑制劑結合的重要位點，人體PPO在Phe392和Leu372殘基上相對于煙草PPO的差異是使得抑制劑對人體PPO的抑制活性較差的主要因素;而枯草芽孢桿菌PPO在上述位點的殘基性質相對于煙草PPO表現(xiàn)除了較大的差異，使得抑制劑不能結合到上述位點，從而產生抑制劑的抗性。計算模擬的結果得到了定點突變實驗很好的驗證。<

8、br>　　綜上所述，本文結合生物化學和計算化學方法，對于PPO的分子機制進行了系統(tǒng)研究。識別不同種屬PPO序列和結構上的差異之處，為種屬間PPO性質的研究和定點突變體實驗提供指導。獲得了不同種屬PPO與底物的結合模型，為PPO催化機理的研究和抑制劑的設計提供了基礎和信息。結合定點突變實驗和計算模擬方法，對PPO突變體進行了研究，為理解PPO結構與功能之間的關系提供了指導。發(fā)展了一套能夠定量預測卟啉癥相關PPO突變體的方法，闡述了卟啉癥突