誘導(dǎo)MSP58基因高表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響.pdf

1、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占全部顱內(nèi)腫瘤的30％～50％。盡管近年來在手術(shù)﹑化療與放療方面取得很大進(jìn)步,但對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果并沒有得到顯著提高。腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療困難的根本原因在于其所具有的惡性生物學(xué)特性，如膠質(zhì)細(xì)胞瘤具有典型的過度增殖、極強(qiáng)的侵襲性等等。因此，深入揭示腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生與發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，闡明決定腦膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的關(guān)鍵基因，對(duì)于人類戰(zhàn)勝這一頑疾具有重要的科學(xué)意義。
　　核微球蛋白

2、58(58-kDa microspherule protein，MSP58)是我們以抑癌候選基因NDRG2（N-myc down-stream regulated gene2）為誘餌、利用酵母雙雜交的方法篩選到的一個(gè)可以與NDRG2相互作用的分子。MSP58全長(zhǎng)462個(gè)氨基酸。該分子結(jié)構(gòu)中包括:核仁定位信號(hào);一個(gè)coiled-coil domain和一個(gè)forkhead associated domain(FHA)。目前國(guó)際上對(duì)MSP5

3、8的研究表明：MSP58的表達(dá)與細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)，這個(gè)分子在細(xì)胞中表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期相關(guān)的特點(diǎn)，它在細(xì)胞中過表達(dá)可以引起細(xì)胞的克隆形成能力增強(qiáng)及非錨著依賴生長(zhǎng)的惡性表型，MSP58系與多種腫瘤發(fā)生過程及細(xì)胞增殖中具有相互作用的一種癌基因。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，MSP58mRNA和蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中存在表達(dá)。MSP58表達(dá)在良性和惡性腦膠質(zhì)瘤之間，以及腦膠質(zhì)瘤～ⅠⅣ級(jí)病理級(jí)別間比較均有非常顯著的差異性（p<0.01）

4、，提示MSP58在腦膠質(zhì)瘤的形成和惡性演進(jìn)中具有重要作用。然而對(duì)于MSP58在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。
　　本研究探討了MSP58分子誘導(dǎo)高表達(dá)對(duì)于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系體外增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)特性的影響，為揭示MSP58分子在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性進(jìn)展中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本課題研究主要包括以下兩個(gè)方面：
　　1.MSP58真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251的研究
　　我們?cè)谇?/p>

5、期的研究中，針對(duì)四種最高級(jí)別惡性度的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞系：U215，U87，BT325，SHG44，運(yùn)用RT-PCR和Westernblot的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)了MSP58mRNA和蛋白在這四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSP58在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均有表達(dá)，并且表達(dá)量基本一致。根據(jù)這四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特性及轉(zhuǎn)染效率等特點(diǎn)，我們選取了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251作為研究對(duì)象，根據(jù)MSP58分子的cDNA序列，運(yùn)用PCR得到MSP58全長(zhǎng)，并

6、克隆入pCI-neo載體，構(gòu)建了MSP58真核表達(dá)載體pCI-neo-MSP58，經(jīng)酶切鑒定證實(shí)克隆正確。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)、將pCI-neo-MSP58載體和空載體pCI-neo分別轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251，經(jīng)G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系U251-Pmsp58（MSP58過表達(dá)組）和U251-Pneo（空載體組），經(jīng)RT-PCR和Westernblot檢測(cè)證實(shí)U251-Pmsp58細(xì)胞MSP58mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上

7、調(diào)。
　　本部分結(jié)果提示：首次成功獲得了能夠穩(wěn)定過表達(dá)MSP58的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251-Pmsp58，這為進(jìn)一步研究MSP58表達(dá)對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響提供了良好的細(xì)胞模型。
　　2.誘導(dǎo)MSP58高表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖及侵襲的影響
　　本研究觀察了MSP58基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)分為U251-Pmsp58組（MSP58過表達(dá)組）、U251組（未轉(zhuǎn)染組）和U251-Pneo組（空載體

8、組），運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，MTT實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U251-Pmsp58組與其他各對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞明顯減少（p＜0.01），S期細(xì)胞顯著增多（p＜0.01）；U251-Pmsp58組細(xì)胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)均明顯高于其他各對(duì)照組（p＜0.01）。表明MSP58基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞周期有重要影響，MSP58基因表達(dá)上調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖有較為明顯的促進(jìn)作用。
　

9、　為了探明MSP58基因與膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移能力的關(guān)系，運(yùn)用經(jīng)典的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲小室法、就MSP58分子對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U251-Pmsp58組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力明顯高于其他對(duì)照組（p＜0.01），并且在Transwell實(shí)驗(yàn)中，U251-Pmsp58組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)也明顯高于其他對(duì)照組（p＜0.01）。從而證明上調(diào)MSP58基因的表達(dá)能夠促進(jìn)膠質(zhì)

10、瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　本部分研究結(jié)果提示，MSP58的高表達(dá)可能與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。
　　綜上所述，本研究首次建立了具有穩(wěn)定上調(diào)MSP58基因mRNA和蛋白表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；闡明了MSP58基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。作為與NDRG2相互作用的分子，本研究結(jié)果為NDRG2功能的研究開辟了新的領(lǐng)域，對(duì)于揭示腦膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，闡明決定腦膠質(zhì)瘤惡性