RNA干擾抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系EphB4基因表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的： 研究酪氨酸蛋白激酶受體EphB4基因在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá)及其功能特性，尋找診斷、治療膠質(zhì)瘤的新方法和途徑，并為判斷惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后提供有用指標(biāo)。 方法： 1、RT-PCR檢測(cè)U251細(xì)胞和U87細(xì)胞系中EphB4和EphA2基因的表達(dá)情況； 2、體外構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體，進(jìn)一步為體內(nèi)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)； 3、體外合成特異siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入膠質(zhì)瘤U25l細(xì)胞系中，并觀

2、察和檢測(cè)其對(duì)U251細(xì)胞中EphB4基因表達(dá)的抑制情況；4、觀察特異siRNA轉(zhuǎn)入U(xiǎn)251細(xì)胞后是否引起細(xì)胞增殖減慢及誘發(fā)細(xì)胞凋亡，以研究EphB4基因在膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)制；5、研究siRNA對(duì)裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。 結(jié)果： 1、通過(guò)基因水平檢測(cè)，EphB4和EphA2兩基因在U251和U87細(xì)胞中表達(dá)水平存在差異； 2、經(jīng)測(cè)序鑒定及電泳證明已成功構(gòu)建了針對(duì)EphB4基因的shRNA真核表達(dá)載體，

3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可有效抑制EphB4基因表達(dá)； 3、經(jīng)體外化學(xué)合成靶向EphB4基因的特異性siRNA，轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中，可有效抑制EphB4基因的mRNA表達(dá)水平，在實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染siRNA-EphB4 100nm/L，后，使EphB4mRNA的表達(dá)水平下降了75.0％； 4、抑制EphB4基因表達(dá)使腫瘤細(xì)胞的增殖能力減弱，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)不同程度地阻滯于亞G1期，出現(xiàn)凋亡峰，并且細(xì)胞的遷移能力與對(duì)照組比較有所下降，tra

4、nswell小室穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較有明顯差異； 5、成功建立裸鼠U251細(xì)胞皮下移植瘤模型，治療四周后siRNA組腫瘤體積較生理鹽水組縮小，病理學(xué)檢查siRNA組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞散在稀疏。 結(jié)論： 1、EphB4和EpA2基因在U251細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于U87細(xì)胞系，提示兩種不同的細(xì)胞系可能在致瘤機(jī)制上存在差異，為研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供一定的線索； 2、我們構(gòu)建的shRNA真核表達(dá)載

5、體可特異抑制該基因的表達(dá)，達(dá)到類似基因敲除的效果，并且在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞系中，雙鏈RNA能夠長(zhǎng)期發(fā)揮阻斷基因表達(dá)的作用； 3、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可以有效抑制靶基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染特異siRNA后出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯，誘導(dǎo)凋亡，表明EphB4基因在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的惡性進(jìn)展與惡性侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。結(jié)合我們以往的工作經(jīng)驗(yàn)可見(jiàn)RNA干擾作用可有效地應(yīng)用于腫瘤的基因治療領(lǐng)域，并且為研究酪氨酸激酶Eph家族在膠質(zhì)瘤的惡性