PTTG1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和microRNA靶向抑制PTTG1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，為探討PTTG1基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,本課題通過(guò)對(duì)膠質(zhì)瘤中PTTG1表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度、腫瘤細(xì)胞增殖活性及其相互關(guān)系進(jìn)行了研究,并通過(guò)體內(nèi)、體外試驗(yàn)探討PTTG1基因作為基因治療膠質(zhì)瘤優(yōu)選靶的之一的可行性；初步探討PTTG1基因影響腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的可能機(jī)制。 1、人腦膠質(zhì)瘤中PTTG1的表達(dá)和臨床病理相關(guān)性分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法和Western blo

2、t雜交檢測(cè)PTTG1 mRNA和蛋白在正常腦組織、膠質(zhì)瘤和惡性人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的表達(dá)。結(jié)果表明：在正常腦組織中未檢測(cè)到PTTG1 mRNA和蛋白的表達(dá)；在各級(jí)膠質(zhì)瘤中均有PTTG1的表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系；在Ⅲ-IV級(jí)(高惡度)膠質(zhì)瘤中高表達(dá),而在Ⅱ級(jí)(低惡度)膠質(zhì)瘤中表達(dá)量較低,Ⅲ-IV級(jí)與Ⅱ級(jí)PTTG1 mRNA、蛋白的表達(dá)量相比較有顯著差異(P<0.001)。采用免疫組化ABC法檢測(cè)了4例正常腦組織及52例人腦

3、膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本中PTTG1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中基本無(wú)PTTG1蛋白的表達(dá),絕大部分星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中可見(jiàn)PTTG1蛋白的陽(yáng)性表達(dá),其表達(dá)情況為：Ⅱ級(jí)55％(11/20),Ⅲ級(jí)76.2％(11/15),IV級(jí)100％(17/17)。在II、Ⅲ和IV級(jí)3個(gè)不同病理級(jí)別的星形細(xì)胞腫瘤中,PTTG1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率有顯著差別(P<0.01)。大部分其它類(lèi)型的膠質(zhì)瘤中也可見(jiàn)PTTG1蛋白的陽(yáng)性表達(dá),其表達(dá)情況為：少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤

4、75％(3/4),室管膜瘤100％(4/4)。腦膠質(zhì)瘤的臨床病理級(jí)別、分化程度與PTTG1的表達(dá)陽(yáng)性率之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異性(P<0.01);而性別和年齡則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P>0.05)。用Ki-67標(biāo)記指數(shù)(Ki-67 LabelingIndex)評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤的增殖活性,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)對(duì)于腫瘤的侵襲具有極其重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以免疫組化法檢測(cè)了Ki-67、MMP2和

5、MMP9的表達(dá)強(qiáng)度,Ki67 LI檢驗(yàn)三種病理級(jí)別膠質(zhì)瘤Ki67表達(dá)情況,其表達(dá)情況為:Ⅱ級(jí)(1.88),Ⅲ級(jí)(8.94),Ⅳ級(jí)(13.77),統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P<0.001),說(shuō)明Ki67 LI在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中具有顯著性差異。39例膠質(zhì)瘤中MMP2、MMP9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別是:Ⅱ級(jí)的纖維型星形細(xì)胞瘤陽(yáng)性表達(dá)45％、40％,Ⅲ級(jí)的間變型星形細(xì)胞瘤80％、86.7％,Ⅳ級(jí)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤均為100％,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P<0.01

6、)。膠質(zhì)瘤中Ki-67LI、MMP2、MMP9的表達(dá)與PTTG1基因表達(dá)、腫瘤分級(jí)呈正相關(guān),結(jié)果提示膠質(zhì)瘤中PTTG1基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖活性、侵襲性密切相關(guān)。 2、microRNA靶向性抑制PTTG1表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖、凋亡以及侵襲性的影響 利用兩個(gè)惡性膠質(zhì)瘤體外細(xì)胞系U251和SHG-44為模型,將含靶向PTTG1的microRNA(miRNA)的質(zhì)粒pcDNAmTM6.2-GW/EmGFPmiR通過(guò)Li

7、pofectamine介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和SHG-44惡性星形細(xì)胞瘤細(xì)胞,通過(guò)熒光定量PCR、Western blot、激光共聚焦顯微鏡、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)以及Caspase-3檢測(cè)定性和定量研究了miRNA-PTTG1抑制PTTG1的表達(dá),以及了解對(duì)L1251、SHG-44體外細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲性的影響。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的U251、SHG-44細(xì)胞克隆生長(zhǎng)速度明顯下降。采用FCM

8、定量分析各組細(xì)胞的調(diào)亡水平。結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞(早期調(diào)亡細(xì)胞16.9％)和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的U251細(xì)胞(早期調(diào)亡細(xì)胞14.9％)相比,轉(zhuǎn)染MIR-2干擾質(zhì)粒U251細(xì)胞中調(diào)亡細(xì)胞明顯增多,48小時(shí)后調(diào)亡細(xì)胞達(dá)20.4％,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P<0.001);在SHG-44細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與未轉(zhuǎn)染的SHG-44細(xì)胞(早期調(diào)亡細(xì)胞15.2％)和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的SHG-44細(xì)胞(早期調(diào)亡細(xì)胞14％)相比,轉(zhuǎn)染MIR-2干擾質(zhì)粒SHG-44細(xì)

9、胞中調(diào)亡細(xì)胞明顯增多,48小時(shí)后調(diào)亡細(xì)胞達(dá)22.2％,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P<0.001)。Matrigel體外侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miRNA-PTTG1的U251細(xì)胞與U251對(duì)照組和陰性載體干擾組比較侵襲能力分別下降了36.5％和30％,遷移能力下降了64.2％和64.7％。Western blot分析;miRNA干擾PTTG1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)后,與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白Ki-67、c-myc表達(dá)下調(diào)；細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)的蛋白p

10、53、Bax、p21WAF1/Cipl表達(dá)上調(diào)；與腫瘤細(xì)胞侵襲性相關(guān)的蛋白MMP2、MMP9表達(dá)下降(P<0.05)。研究結(jié)果提示：Lipofectamine-pcDNAm6.2-GW/EmGFPmiR-PTTG1復(fù)合物可成功地將針對(duì)PTTG1的外源性miRNA導(dǎo)入至膠質(zhì)瘤內(nèi),抑制腫瘤細(xì)胞的PTTG1基因表達(dá),對(duì)PTTG1 mRNA及蛋白明顯高表達(dá)的U251、SHG-44細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有明顯的抑制作用,誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)亡和降低惡性膠質(zhì)

11、瘤細(xì)胞的侵襲性。結(jié)果提示PTTG1基因有可能成為基因治療惡性膠質(zhì)瘤的優(yōu)選靶之一。 3、microRNA抑制PTTG1蛋白對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠成瘤性的影響 在裸鼠成瘤試驗(yàn)中,我們將U251細(xì)胞(A組),U251+pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-negative(轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒U251細(xì)胞)細(xì)胞(B組)和U251+pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-PTTG1(轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒U251細(xì)胞)細(xì)胞(C組)分別

12、接種于裸鼠背部皮下,每組5只裸鼠,建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,測(cè)定腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn),觀察4周后處死動(dòng)物,稱(chēng)瘤重。接種4周后,肉眼就可以看到,接種正常U251細(xì)胞的腫瘤明顯大于其他兩組。接種正常U251細(xì)胞的腫瘤明顯大于其他兩組。4周時(shí)測(cè)得的各組腫瘤體積分別為:Mock-U251組為(2.36±0.22)cm3;Negative-U251組為(2.06±0.08)cm3;Mir-2-U251組為(1.

13、50±0.05)cm3。處死后,切下3組腫瘤分別稱(chēng)重,Mock-U251組平均瘤重為(1.71±0.13)g,Negative-U251組為(1.43±0.19)g;Mir-2-U251組為(0.74±0.07)g,結(jié)果顯示,與A組和B組裸鼠相比,C組裸鼠腫瘤形成時(shí)間延遲,腫瘤生長(zhǎng)緩慢,腫瘤體積及瘤重均明顯減小(P均<0.05)。HE染色顯示各組腫瘤組織符合多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形態(tài),靶向抑制PTTG1的miRNA干擾治療后出現(xiàn)了腫瘤中心

14、壞死,壞死區(qū)細(xì)胞稀疏,向外細(xì)胞漸增多,其間含有很多的破碎細(xì)胞,再向外則為密集的瘤細(xì)胞,并有細(xì)胞內(nèi)、外的水腫和出血,同時(shí)也有不同程度的核固縮細(xì)胞。Westernblot檢測(cè)顯示,與A組和B組相比,C組裸鼠腫瘤組織中活性的Capase-3蛋白明顯上調(diào)(P<0.001)。上述結(jié)果提示在裸鼠腫瘤細(xì)胞中miRNA可通過(guò)抑制PTTG1蛋白的表達(dá)來(lái)拮抗PTTG1蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用,并激活活性Capase-3蛋白表達(dá),從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

15、 綜上所述,本課題的結(jié)論是在膠質(zhì)瘤組織中,PTTG1蛋白表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增加相應(yīng)增高,PTTG1在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中高表達(dá)。PTTG1表達(dá)的升高與腫瘤分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。人腦膠質(zhì)瘤中PTTG1、MMP2、MMP9、Ki67的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)成正相關(guān),提示在惡性膠質(zhì)瘤中PTTG1與膠質(zhì)瘤的惡性表型(增殖和侵襲)密切相關(guān)。microRNA干擾PTTG1表達(dá)后,western blot檢測(cè)的細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原Ki

16、67以及MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的靶標(biāo)c-myc的表達(dá)下調(diào),MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示抑制PTTG1表達(dá)后U251、SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞增殖率均明顯下降,都出現(xiàn)了生長(zhǎng)減慢。利用基因沉默技術(shù)靶向PTTG1的microRNA表達(dá)載體有效地抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和SHG-44中PTTG1的表達(dá),p53以及其下游調(diào)控基因p21WAF1/Cip1、Bax的表達(dá)都發(fā)生上調(diào)的變化,caspase-3的相對(duì)活性明顯升高,從而導(dǎo)致P53功能上調(diào)引起

17、Bax、P21表達(dá)上調(diào)從而激活caspase-3最終誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。PTTG1的RNA干擾可以明顯逆轉(zhuǎn)U251人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的侵襲和遷移,MMP2、MMP9 Western雜交結(jié)果顯示表達(dá)顯著減少,提示PTTG1→bFGF→MMP→腫瘤細(xì)胞基底膜屏障突破這一調(diào)節(jié)通路可能是惡性腦膠質(zhì)瘤侵襲性產(chǎn)生的重要機(jī)制之一。轉(zhuǎn)染外源性microRNA抑制PTTG1基因的U251細(xì)胞在無(wú)免疫裸鼠皮下成瘤后,細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑