右旋檸烯抗胃癌轉移機制實驗研究.pdf

1、該實驗將檢測多種人胃癌細胞和手術切除胃癌標本中VEGF-C表達水平,分析其與腫瘤生物學行為和臨床病理特征的關系,并在此基礎上,通過體內(nèi)裸小鼠原位移植模型和體外粘附、侵襲實驗評價右旋檸烯對胃癌轉移能力的抑制作用,在細胞和分子水平探討其作用機理,并為該藥的臨床應用提供理論依據(jù).第一部分 胃癌細胞VEGF-C表達水平與粘附、侵襲能力的關系 目的:觀察不同胃癌細胞株VEGF-C蛋白表達與胃癌細胞體外粘附、侵襲能力的關系,探討VEGF-C對胃癌細

2、胞轉移潛能的作用.方法:三種人胃腺癌細胞BGC-823、SGC-7901、MKN-45,常規(guī)RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5﹪CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取決于對數(shù)生長期的細胞備用.Western-blot法檢測腫瘤細胞裂解液中VEGF-C蛋白表達水平;以纖維粘連蛋白和層粘連蛋白為作用對象,檢測不同胃癌細胞與細胞外基質粘附作用;利用Transwell小室,以Matrigel和纖維粘連蛋白構建重組基底膜,檢測胃癌細胞侵襲人工基底

3、膜能力;針對VEGF-C基因編碼區(qū)設計合成反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN),通過脂質體介導對VEGF-C高表達胃癌細胞株進行轉染;蛋白印跡檢測反義寡核苷酸封阻后VEGF-C和基質金屬蛋白酶2(matrix metal proteinase 2,MMP-2)蛋白表達;體外粘附實驗和侵襲實驗檢測胃癌細胞腫瘤生物學行為的改變.第二部分 右旋檸烯對高轉移人胃癌細胞體外粘附、侵襲能力的抑制

4、目的:以高淋巴結轉移人胃癌細胞株SGC-7901為對象,觀察右旋檸烯對腫瘤細胞粘附、侵襲等轉移相關腫瘤生物學行為的影響,探討其抗腫瘤作用機制.方法:1、以MTT比色法檢測右旋檸烯對胃癌細胞生存的抑制作用,確定右旋檸烯無毒劑量(對細胞生存無明顯細胞毒作用的最大劑量);2、以纖維粘連蛋白和層粘連蛋白(細胞外基質主要成分)為作用對象,檢測右旋檸烯對胃癌細胞與細胞外基質粘附作用的影響;3、利用Transwell小室,以Matrigel和Fibr

5、onectin構建重組基底膜,檢測右旋檸烯對腫瘤細胞侵襲人工基底膜能力的影響;4、應用Western-blot法檢測右旋檸烯對腫瘤細胞SGC-7901條件培養(yǎng)液(conditional medium,CM)中VEGF-C、MMP-2和組織基質蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix proteinase,TIMP-2)蛋白表達的影響.第三部分 人胃癌VEGF-C表達與腫瘤微血管、淋巴管密度及淋巴轉移的關系 目的

6、:探討人胃癌組織VEGF-C表達與血管、淋巴管密度及腫瘤淋巴道轉移的關系.方法:采用免疫組化SP法檢測68例人胃癌組織中VEGF-C、CD-31及淋巴管內(nèi)皮標記物VEGFR-3,計算VEGF-C表達陽性率及腫瘤微血管和微淋巴管密度.第四部分 右旋檸烯對人胃癌移植瘤淋巴轉移的抑制 目的:觀察右旋檸烯(d-limonene,D-L)對人胃癌淋巴轉移的作用,探討其抗腫瘤轉移機制.方法:人胃癌細胞株SGC-7901裸鼠皮下接種,成瘤后傳代獲得實