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文檔簡介
1、胃癌轉(zhuǎn)移是多基因參與,受多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的一個復(fù)雜的過程,而轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用是轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵問題,可能為胃癌轉(zhuǎn)移研究提供新的預(yù)測指標(biāo)和干預(yù)靶點。目前關(guān)于胃癌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要包括AP-1,NF-κB,Sp1,EGR,CREB,ATFs等,這些轉(zhuǎn)錄因子并不能完全解釋胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制,新的轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)及其具體調(diào)控通路的分子機制研究迫在眉睫。
既往的研究表明,SRF可能是一個潛在的促腫瘤轉(zhuǎn)移分子,它可以在體外促
2、進結(jié)腸癌、肺癌及乳腺癌細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)移;而其具體機制、通過哪些分子、通路發(fā)揮作用還不清楚。同時,SRF在胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮什么作用、及其具體作用機制有待于進一步深入探討。本課題將對以上這些問題進行研究。
【目的】
1、通過體內(nèi)篩選探討參與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子;
2、探討篩選出的轉(zhuǎn)錄因子SRF與胃癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移及粘附等的相關(guān)性;
3、找出SRF下游效應(yīng)miRNA分子,探討SRF促進胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能機
3、制的影響。
【方法】
1、采用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片方法通過兩次比較高、低轉(zhuǎn)移潛能的胃癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞系得到與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子并驗證;
2、采用Westernblot、免疫組織細(xì)胞化學(xué)觀察活性的SRF蛋白在胃癌有轉(zhuǎn)移組織中的表達和細(xì)胞定位;
3、通過基因重組方法構(gòu)建SRF的siRNA質(zhì)粒、全長上調(diào)質(zhì)粒(饋贈)和對照質(zhì)粒;
4、采用體外細(xì)胞粘附實驗、侵襲、遷移實驗、體內(nèi)裸鼠尾靜脈注射肝臟轉(zhuǎn)移實
4、驗等研究SRF對胃癌細(xì)胞GC9811、GC9811-P和SGC7901的粘附、侵襲、遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響;
5、通過realtimePCR檢測胃癌轉(zhuǎn)移組織及細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染SRFsiRNA質(zhì)粒后的SRF、miR-199a-5p、miR-199a-3p表達水平變化;
6、采用染色質(zhì)CHIP、啟動子報告基因、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測SRF與miR-199a基因是否存在直接的正向或者負(fù)向調(diào)控關(guān)系。同時通過體外實驗驗證mi
5、R-199a對腫瘤的轉(zhuǎn)移能力的影響。
【結(jié)果】
1、通過體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子
我們采用高通量轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片,通過對體內(nèi)篩選得到的低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞系GC9811和高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞系GC9811-P兩種細(xì)胞系進行兩次篩選,得到了20個可能與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。其中包括目前已報道與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,AP-1,ATFs,Sp1,CREB,EGR。經(jīng)過ELISA驗證,我們選擇其
6、中SRF為研究對象進行進一步探討。
2、有活性的轉(zhuǎn)錄因子SRF在轉(zhuǎn)移胃癌組織及細(xì)胞中表達升高
我們采用免疫組化技術(shù)檢測了活化的SRF蛋白在25例胃的正常組織、25例沒有腸化生的炎癥組織、21例慢性胃炎伴腸化生組織、28例胃癌原發(fā)灶和26胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、22例遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移組織中的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與原發(fā)灶等組織相比,活化的SRF(p-SRF)主要定位于胃癌轉(zhuǎn)移組織細(xì)胞的胞漿和胞核中,以胞核為主。采用WesternBlot方法
7、檢查6例胃癌的癌旁組織、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的胞漿蛋白和胞核蛋白表達,結(jié)果與免疫組化相同。同樣,SRF在低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞GC9811中主要為胞漿表達,而在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞GC9811-P細(xì)胞中主要為胞核表達。以上結(jié)果提示:SRF在胃癌組織細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移早期主要在胞漿中表達,經(jīng)過磷酸化后活化的SRF從胞漿中轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核,進而促進胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。
3、體內(nèi)、外實驗證實轉(zhuǎn)錄因子SRF可以促進胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。
我們進而構(gòu)建了SRF的
8、siRNA載體,同時也購買了SantaCruz的siRNA載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或者瞬時轉(zhuǎn)染了胃癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P細(xì)胞和胃癌SGC7901細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRFsiRNA轉(zhuǎn)染后,GC9811-P細(xì)胞和SGC7901對細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel的粘附能力下降。敲除SRF也抑制了GC9811-P細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞穿過帶Matrigel膠或者沒有鋪膠的Millicell小室遷移能力及劃痕實驗中兩細(xì)胞的遷移能力,進而證明SRF可以影響胃
9、癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。體內(nèi)裸鼠尾靜脈注射遷移實驗表明,SRFsiRNA能明顯抑制GC9811-P及SGC7901細(xì)胞的肝臟、肺臟及腹膜轉(zhuǎn)移能力。采用SRF全長質(zhì)粒上調(diào)胃癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811及SGC7901細(xì)胞系后,兩細(xì)胞系的侵襲、遷移、粘附能力顯著增強。上述結(jié)果提示,胃癌細(xì)胞中的SRF是影響胃癌細(xì)胞侵襲、遷移、粘附和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的重要分子。
4、轉(zhuǎn)錄因子SRF通過調(diào)控miR-199a分子的表達促胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。
10、r> 先前有研究提示SRF在心肌細(xì)胞中可通過影響含有CArG元件的miRNAs分子的表達來發(fā)揮其調(diào)控作用。我們進一步用realtimePCR方法證實SRF能上調(diào)miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達。同時實驗中也發(fā)現(xiàn),與對照組織相比,在SRF高表達的胃癌轉(zhuǎn)移組織及細(xì)胞中,miR-199a-3p和miR-199a-5p也為高表達。SRFsiRNA轉(zhuǎn)染敲除SRF的表達后,GC9811-P細(xì)胞中的miR-199a-3p和miR
11、-199a-5p表達顯著下調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)在胃癌高轉(zhuǎn)移GC9811-P細(xì)胞中的SRF在細(xì)胞核內(nèi)可以直接結(jié)合miR-199a-1和miR-199a-2的啟動子區(qū)域,進而正向啟動miR-199a-1和miR-199a-2的轉(zhuǎn)錄,其成熟的miRNAs分子中miR-199a-5p可以促進胃癌轉(zhuǎn)移,而miR-199a-3p沒有顯著作用。
【結(jié)論】
本研究經(jīng)過胃癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型篩選出與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,并發(fā)現(xiàn)其中有活性的轉(zhuǎn)錄因子
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