miR-31抑制胃癌轉(zhuǎn)移功能及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　miR-31定位在9p21.3,在不同腫瘤中的表達有非常明顯的差異,但其參與腫瘤的生物學功能尚未得到很好闡明。國外研究發(fā)現(xiàn),miR-31在乳腺癌細胞中相對低表達,且與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。進一步的研究揭示其可能通過作用于ITGA5、RDX和RhoA等靶分子抑制乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。我們先前在對胃遠端腺癌組織miRNA表達譜進行基因芯片研究,發(fā)現(xiàn)miR-31在遠端胃腺癌組織中呈明顯低表達。初步的細胞學研究發(fā)現(xiàn),增加胃

2、癌細胞中miR-31的表達,可抑制腫瘤細胞的移動能力,提示其可能參與了胃癌細胞的轉(zhuǎn)移過程。所以,在以往工作的基礎(chǔ)上,進一步深入研究miR-31在胃癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用及機制,將有助于揭示miR-31在腫瘤中的生物學功能和胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　目的:
　　1.檢測miR-31在人胃癌組織及細胞系中的表達狀況并分析其與胃癌臨床病理因素的相關(guān)性;
　　2.以胃癌細胞系SGC-7901和 BGC-823為模型,

3、通過體外實驗研究miR-31表達改變對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移和粘附等功能的影響;
　　3.利用miRNA靶基因預(yù)測軟件,預(yù)測并鑒定可能參與miR-31功能的靶基因。
　　方法:
　　1.檢測miR-31在胃癌組織及細胞中的表達:選取我院普通外科手術(shù)胃癌組織20例,通過實時定量RT-PCR方法檢測miR-31在其中的表達情況,并選取其癌旁組織作為對照;通過非參數(shù)檢驗,分析miR-31的表達豐度與胃癌患者年齡、性別、腫瘤

4、大小、組織學分型及 TNM分期的相關(guān)性。以人胃粘膜上皮細胞GES-1為對照,通過實時定量RT-PCR方法檢測miR-31在人胃癌細胞系SGC-7901及BGC-823中的表達狀況。
　　2.MiR-31對胃癌細胞生物學功能的影響:利用細胞凋亡檢測、細胞平板克隆實驗、侵襲遷移實驗、細胞劃痕實驗、細胞粘附實驗,研究 miR-31表達改變對胃癌SGC-7901及BGC-823細胞的增殖、凋亡、侵襲、移動和粘附功能的影響。
　　3.

5、MiR-31靶基因的預(yù)測:通過 PicTar, TargetScan和 miRDB等常用miRNA靶基因預(yù)測軟件,共同預(yù)測出miR-31作用的重要靶基因;并在文獻回顧的基礎(chǔ)上篩選出與胃腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的基因,并進行 Western-Blot驗證。
　　結(jié)果:
　　1.實時熒光定量 RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-31在胃癌組織中的表達豐度明顯低于其配對的癌旁組織(P<0.05);與癌旁組織相比較,平均下調(diào)至0.41倍。統(tǒng)計

6、學分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-31的表達與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(P<0.01),T、N分期越差,miR-31表達也隨之降低(P<0.05),而與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學分型無明顯相關(guān)性(P>0.05);miR-31在胃癌細胞系SGC-7901及BGC-823中的表達均較人胃粘膜上皮細胞系GES-1明顯降低(P<0.05)。
　　2.通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)胃癌SGC-7901及BGC-823細胞中miR-31的

7、表達,并通過RT-PCR檢測證實轉(zhuǎn)染成功;細胞凋亡檢測及細胞平板克隆實驗提示,增加胃癌細胞中miR-31的表達,腫瘤細胞的凋亡及克隆形成能力無明顯變化。侵襲遷移實驗提示,增加胃癌細胞中miR-31的表達,可明顯抑制 BGC-823細胞的侵襲及遷移能力;細胞劃痕實驗提示,增加胃癌SGC-7901細胞中miR-31的表達,可明顯抑制細胞的移動能力;細胞粘附實驗提示,增加胃癌SGC-7901細胞中miR-31的表達,其細胞粘附率明顯下降。

8、r>　　3.通過 PicTar, TargetScan和 miRDB等軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn) AKAP7、APBB2、CTNND2、HIAT1、HIF1AN、JAZF1、KHDRBS3、MAP4K5、PEX5、PPP2R2A、RGS4、RHOA、RSBN1、SEPHS1、SH2D1A、SLC6A6、SNX4、 STX12、TACC1、TACC2、YWHAE等21個分子為miR-31的共同靶基因。進一步通過Pubmed檢索發(fā)現(xiàn)CTNND2, KHD

9、RBS3, RHOA, TACC1及YWHAE等5個為與胃癌相關(guān)的基因,其中RHOA經(jīng)Western-Blot證實可能為miR-31作用于胃癌細胞的靶基因。
　　結(jié)論:
　　1.miR-31在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用:miR-31在胃癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低,其表達豐度與胃癌組織的N分期呈負相關(guān);
　　2.miR-31可抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,但對細胞的凋亡增殖無明顯影響;
　　3.預(yù)測RhoA