阻斷UPP對腦缺血大鼠NF-κB、p53的作用機制研究.pdf

1、背景與目的:泛素-蛋白酶體通路(UPP)是細(xì)胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑，參與炎癥反應(yīng)等的調(diào)節(jié)。大量研究證明炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要病理生理機制。NF-K B轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)因子的表達(dá)而被認(rèn)為是腦缺血后炎癥反應(yīng)中最重要的調(diào)控因子之一?？梢娹D(zhuǎn)錄活性是決定NF-KB功能的關(guān)鍵因素。UPP通過降解泛素化IKB而使NF-KB激活。用蛋白酶體抑制劑阻斷UPP可抑制它的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)節(jié)NF-KB調(diào)控的炎癥反應(yīng)。在腦缺血模型中用蛋白酶

2、體抑制劑阻斷UPP是否可通過抑制NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用這方面的研究國內(nèi)未見相關(guān)報道。因此設(shè)想在腦缺血模型中可通過阻斷LIPP，抑制NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性，從而減輕腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)。試圖從炎癥反應(yīng)方面說明阻斷UPP產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的機理，為臨床治療腦缺血提供理論基礎(chǔ)和新方法。 方法:健康雄性SD大鼠132只隨機分為5個組：正常組、假手術(shù)組、生理鹽水對照組、缺血組和干預(yù)組。后2組根據(jù)再灌注時間又分為再灌注6h、

3、12h、24h、和7d亞組。線栓法制作大腦中動脈缺血2h再灌注模型。干預(yù)組在缺血再灌注后立即靜脈給予clasto-1actacystin β-1actone(O.03mg／kg)以阻斷UPP。前3組在術(shù)后24h處死動物，后2組在相應(yīng)時間點處死動物。斷頭取腦，制作石蠟切片。HE染色觀察白細(xì)胞浸潤。免疫組織化學(xué)方法檢測NF-KB蛋白的表達(dá)。RT-PCR檢測NF-KBmRNA的表達(dá)。TTC染色測梗死體積。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)結(jié)合F

4、ITC標(biāo)記NF-KB p65亞基和PI標(biāo)記細(xì)胞核的熒光雙標(biāo)技術(shù)對NF-KB進(jìn)行定位和定量分析，顯示其轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果: 1．腦缺血再灌注6h開始出現(xiàn)NF-K B蛋白及其mRNA的表達(dá)，NF-K B mRNA表達(dá)于12h達(dá)高峰而NF-KB蛋白表達(dá)于24h達(dá)高峰，之后逐漸減少，至7d時仍見有表達(dá)。正常組和假手術(shù)組未見NF-KB表達(dá)。生理鹽水對照組NF-KB表達(dá)增加，與缺血再灌注24h亞組比較p>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。干預(yù)組

5、，給予clasto-lactacyst in斷Upp后,見各時間點Nf-Kb表達(dá)減少,與缺血組比統(tǒng)計學(xué)意義。 2.腦缺血再灌注6h開始出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤,之后逐漸增多,24h達(dá)高峰,7d仍見炎性細(xì)胞浸潤。正常組和假手術(shù)組未見白細(xì)胞浸潤。生理鹽水對照組白細(xì)胞浸潤增加,與缺血再灌注24h亞組比較P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)差異。干預(yù)組各時間點白細(xì)胞浸潤減輕,與缺血組比較P<0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.腦缺血再灌注6h開始出現(xiàn)腦梗死,

6、于24h達(dá)高峰。正常組和假手術(shù)組未見腦梗死。生理鹽水對照組梗死體積增大,與缺血再灌注24h亞組比較p<0.05,無統(tǒng)計學(xué)差異。干預(yù)組各時間點梗死體積縮小,至24h和7d分別縮小了44[％]和36[％]。與缺血組比較,除再灌注6h亞組外,其余各亞組P<0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.腦缺血再灌注24hclsm見細(xì)胞核中出現(xiàn)代表nf-Kb的綠色熒光,顯示Nf-Kb激活。干預(yù)組見細(xì)胞核中綠色熒光減少,細(xì)胞核區(qū)綠色熒光與細(xì)胞漿區(qū)綠色熒光的