PLMTs家族成員SET7-9甲基化p53對(duì)NF-κB途徑的影響.pdf

1、研究背景與目的：SET7/9是蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein lysine methyltransferases，PLMTs或PKMTs)家族成員，除了能使組蛋白H3第四位賴(lài)氨酸(lysine4 of histone3，H3K4)單甲基化外，更重要的是使一些轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子、膜相關(guān)受體等非組蛋白單甲基化。p53與p65都是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，兩者相互作用，共同參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、癌變和個(gè)體發(fā)育等生命活動(dòng)。同時(shí)，p

2、53與p65都是SET7/9甲基化作用底物。近來(lái)發(fā)現(xiàn)SET7/9能通過(guò)甲基化第372位賴(lài)氨酸(K372)調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性。本研究初步觀察了SET7/9甲基化p53對(duì)NF-κB途徑的效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
　　(一)分析SET7/9甲基化作用對(duì)p53途徑的影響。首先用1μmol·L-1濃度的阿霉素(Adriamycin，Adr)處理HEK293細(xì)胞20h，RT-PCR法檢測(cè)p21 mRNA表達(dá)水平，可見(jiàn)Adr處理HEK

3、293細(xì)胞后p21 mRNA表達(dá)明顯增加，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示Adr作用后HEK293細(xì)胞凋亡率上升，提示DNA損傷后p53途徑激活；若用1 mmol·L-1。濃度的廣譜蛋白甲基化抑制劑MTA處理細(xì)胞1h，再用Adr處理20h，則可抑制Adr誘導(dǎo)的p21表達(dá)，說(shuō)明p53途徑活化與胞內(nèi)蛋白甲基化修飾有關(guān)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染SET7/9表達(dá)載體(pCMV-SET7/9)、SET7/9干擾RNA(shRNA-SET7/9)質(zhì)粒后再用1μmol·L-1Ad

4、r處理20h，結(jié)果表明SET7/9強(qiáng)化表達(dá)時(shí)Adr誘導(dǎo)的p21表達(dá)量明顯增高，敲除SET7/9則抑制Adr誘導(dǎo)的p21表達(dá)，證實(shí)了SET7/9對(duì)p53途徑活化的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53干擾RNA(shRNA-p53)或空載體(pIRES2-ZsGreen1)后用Adr處理20h，發(fā)現(xiàn)敲除p53基因能抑制p53表達(dá)及SET7/9依賴(lài)的p21表達(dá)，而將野生型和突變型p53(p53K372R)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示

5、轉(zhuǎn)染野生型p53后，SET7/9過(guò)表達(dá)可促進(jìn)HEK293細(xì)胞的凋亡，而轉(zhuǎn)染突變型p53后，SET7/9過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，提示SET7/9激活p53途徑的效應(yīng)是通過(guò)甲基化p53實(shí)現(xiàn)的。
　　(二)分析SET7/9誘導(dǎo)的p53甲基化對(duì)NF-κB途徑的影響。細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-SET7/9、shRNA-SET7/9后用Adr處理或不處理，酶標(biāo)儀檢測(cè)NF-κB途徑靶向熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)pCMV-SET7/9轉(zhuǎn)染+Adr處理

6、組熒光素酶活性比pCMV轉(zhuǎn)染+Adr組熒光素酶活性高，shRNA-SET7/9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+Adr處理組熒光素酶活性比pCMV+Adr組熒光素酶活性低，提示SET7/9對(duì)p53途徑的甲基化作用可調(diào)節(jié)NF-κB途徑活性。pCMV-SET7/9轉(zhuǎn)染+Adr處理組熒光素酶活性比轉(zhuǎn)染pCMV-SET7/9組高，表明SET7/9過(guò)表達(dá)時(shí)Adr誘導(dǎo)p53途徑激活與NF-κB途徑活性變化相關(guān)，shRNA-SET7/9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+Adr處理組熒光素酶活性與s