Wnt10a-Wnt10b及其Wnt-β-catenin通路在子宮內(nèi)膜癌中的作用研究.pdf

1、第一部分 Wnt10a和Wnt10b在子宮內(nèi)膜癌中的表達和臨床意義
　　目的:通過檢測Wnt10a及Wnt10b在不同狀態(tài)子宮內(nèi)膜組織中表達，分析其與子宮內(nèi)膜癌(EC)患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討Wnt10a及Wnt10b在EC發(fā)生發(fā)展中的作用，判斷EC的生物學(xué)行為。為EC病因?qū)W研究及預(yù)后判斷提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:本研究選取2001年1月至2010年12月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的新發(fā)EC標本102例。其中包

2、括95例雌激素依賴型（Ⅰ型）子宮內(nèi)膜癌（其中12例子宮內(nèi)膜癌伴鱗狀分化）與7例非雌激素依賴型（Ⅱ型）EC（2例漿乳癌，4例粘液腺癌，1例透明細胞癌）。對照組:單純性增生子宮內(nèi)膜(SHE)18例，復(fù)雜性增生子宮內(nèi)膜(CHE)6例，非典型增生子宮內(nèi)膜(AHE)30例，正常子宮內(nèi)膜(NE)84例（其中增生期48例、分泌期36例），所有標本均經(jīng)病理學(xué)證實，其中子宮內(nèi)膜癌標本均為原發(fā)病例且術(shù)前未接受過其他方法治療。收集以上標本制作組織芯片，應(yīng)用免

3、疫組化SP法檢測Wnt10a和Wnt10b在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達情況。采用SPSS14.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，采用卡方(x2)檢驗和Spearman等級相關(guān)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法進行單因素生存曲線分析。P＜0.05視為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:1.Wnt10a在EC組陽性表達率高于AHE、CHE、SHE及NE組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05(x2=2.81，P=0.25); Wnt10b在EC、AHE、CH

4、E、SHE及NE組的陽性表達率逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(x2=8.12，P=0.02)。2.Wnt10a在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達率高于非子宮內(nèi)膜樣腺癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(x2=4.75，P=0.03);然而，Wnt10a在EC組織學(xué)分級、子宮肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及手術(shù)病理分期（FIGO分期）各亞組中的陽性表達率無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05(P=0.36，P=0.75，P=0.37，P=0.54)。Wnt

5、10b在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達率高于非子宮內(nèi)膜樣癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(x2=2.81，P=0.04)。Wnt10b在高分化(G1)、中分化(G2)和低分化(G3)組EC中陽性表達率逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(x2=6.87，P=0.03); Wnt10b在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組陽性表達率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組P＜0.05(P=0.02); Wnt10b在FIGO分期各亞組中陽性表達率有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05(P

6、=0.04); Wnt10b在EC肌層浸潤各亞組中的陽性表達率無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05(x2=2.27，P=0.13)。3.Wnt10a和Wnt10b在EC組織中的表達無明顯相關(guān)性， P＞0.05(rs=0.08，P=0.43)。4預(yù)后分析:對102例EC患者進行隨訪。Wnt10a陽性表達與陰性表達患者的預(yù)后沒有明顯差別，P＞0.05(x2=0.027，P=0.868)。然而，Wnt10b高表達組EC患者的預(yù)后好于低表達組，差異有統(tǒng)計

7、學(xué)意義，P＜0.05(x2=3.952,P=0.047)。
　　結(jié)論:Wnt10b在EC發(fā)生發(fā)展中很可能起到重要作用。Wnt10b表達陽性組的患者預(yù)后好于陰性組患者。然而，Wnt10a在EC中的作用仍需要進一步研究。
　　第二部分子宮內(nèi)膜癌與經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)性的研究
　　目的:觀察Wnt10b基因通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖與凋亡的作用機理，進一步證實經(jīng)典Wnt信號通路在EC發(fā)生

8、發(fā)展中的作用，為EC發(fā)病機理提供理論依據(jù)。
　　方法:Wnt10b在AN3CA細胞系中呈低表達狀態(tài)，而在Ishikawa3-H-12細胞系中呈高表達狀態(tài)。因此，本研究采用上述兩種EC細胞系作為體外細胞模型，觀察了Wnt10b對Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子β-catenin、APC、c-myc的變化影響。細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存，均嚴格按照無菌操作要求進行。MTT法檢測細胞增殖狀態(tài)。流式細胞儀檢測細胞凋亡。質(zhì)粒

9、轉(zhuǎn)染及siRNA干擾后檢測Wnt10b在mRNA水平上對Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子β-catenin、 APC、 c-myc的影響。Western-blot法檢測Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、 APC、 c-myc的表達含量。數(shù)據(jù)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、Fisher精確檢驗和t檢驗，P＜0.05視為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:1.Wnt10b對EC細胞增殖的影響:

10、在AN3CA細胞系過表達Wnt10b后，其細胞增殖水平明顯高于陰性對照組和空白對照組;在Ishikawa3-H-12細胞系敲降Wnt10b，結(jié)果顯示，Wnt10b敲掉組的細胞增殖水平明顯低于陰性對照組和空白對照組。說明Wnt10b具有促進EC細胞增殖的作用。2.Wnt10b對EC細胞凋亡的影響:在本研究中同樣采用AN3CA和Ishikawa3-H-12細胞系觀察Wnt10b對EC細胞凋亡的影響。流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡水平。在AN3

11、CA細胞中過表達Wnt10b后，其細胞凋亡率明顯低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05）。與此相對應(yīng)，在Ishikawa3-H-12細胞中敲降Wnt10b后，其細胞凋亡率明顯高于陰性對照組和空白對照組(P＜0.01)。說明Wnt10b具有明顯抑制EC細胞凋亡的作用。3.Wnt10b對Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子在轉(zhuǎn)錄水平的影響:(1)在ECAN3CA細胞系中轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt10b過表達質(zhì)粒，RT-PCR方法觀察轉(zhuǎn)染效率，Wnt

12、10b表達明顯增加，說明轉(zhuǎn)染成功。我們發(fā)現(xiàn)β-catenin和c-myc表達明顯增加，而APC表達下降。(2)在Ishikawa3-H-12細胞系中敲降Wnt10b，RT-PCR驗證敲降效率比較明顯，β-catenin和c-myc表達下降，而APC表達上升。說明Wnt10b在轉(zhuǎn)錄水平上通過活化經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵因子，誘導(dǎo)靶基因表達，從而促進EC細胞增殖和抑制其凋亡。4.Wnt10b對Wnt/β-catenin

13、信號通路關(guān)鍵因子在翻譯水平的影響:(1)在AN3CA細胞系中轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt10b過表達質(zhì)粒，Western Blot方法觀察轉(zhuǎn)染效率比較明顯， Wnt10b蛋白表達明顯增加，同時，β-catenin和c-myc表達也明顯增加，而APC表達明顯下降。(2)在Ishikawa3-H-12細胞系中敲降Wnt10b，Western Blot方法驗證敲降效率比較明顯。Wnt10b蛋白表達明顯下降，同時，β-catenin和c-myc表達也明顯下降，而

14、APC表達明顯上升。說明Wnt10b蛋白通過活化經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵蛋白，誘導(dǎo)靶基因表達，從而促進EC細胞增殖和抑制其凋亡。
　　結(jié)論:Wnt10b在EC的發(fā)生發(fā)展中可能起到了重要作用，其機理涉及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的激活及其對下游基因的調(diào)控。結(jié)合本研究結(jié)果進行分析，Wnt10b在EC細胞中的過表達可激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路，降低其負調(diào)控因子APC的表達，促進β