龜板防治GIOP中miRNA調(diào)控Wnt-β-catenin通路的機理研究.pdf

1、目的:
　　1.篩查GIOP患者椎體骨組織中差異表達的miRNA并通過生物信息學分析預測Wnt/β-catenin通路相關的靶基因，初步揭示GIOP的發(fā)病機制;
　　2.明確補腎中藥龜板在體內(nèi)防治GIOP的作用并探討差異miRNA let-7f調(diào)控wnt/β-catenin信號通路在補腎中藥龜板防治GIOP過程的作用;
　　3.探討補腎中藥龜板有效成分促進BMSCs增殖和成骨分化的作用及l(fā)et-7f對TNFR2的靶向調(diào)

2、控作用。
　　方法:
　　1.臨床研究
　　(1)高通量測序篩查差異miRNA及其靶基因預測
　　選取2014年10月-2015年10月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科入院需要行脊柱手術治療的患者6例，其中GIOP患者3例，正常對照組3例。收集其椎體骨進行總RNA提取，高通量測序篩查椎體骨組織中差異miRNA;生物信息學對差異miRNAs進行聚類分析，預測差異miRNA靶基因，并進行GO分析、Pathway分析

3、和新miRNAs預測。
　　(2) RT-qPCR驗證高通量測序篩查的差異miRNAs，預測Wnt/β-catenin通路相關的靶基因
　　選取2014年10月-2016年10月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科收入院需要行脊柱手術治療的患者20例，其中GIOP10例，正常對照組10例。RT-qPCR驗證高通量測序篩查的差異miRNAs，生物信息學分析預測驗證后差異miRNA靶基因，并預測與Wnt/β-catenin通路相關

4、的靶基因。
　　2.動物實驗研究
　　(1)龜板對GIOP大鼠的防治作用
　　200只3月齡SD大鼠隨機分為兩部分，每部分100只，分別用于預防實驗和治療實驗的研究。預防實驗和治療實驗均隨機分為五個組，每組20只，兩部分實驗分組均為:對照組（SHAM組）、模型組（GIOP組）、阿倫磷酸鈉組(ALN組)、龜板組(PT組)，龜板+阿倫磷酸鈉聯(lián)合組（PT+ALN組）。預防實驗在造模的同時給予藥物干預，分別在造?；蚪o藥后1月(

5、M1)、2月(M2)和3月(M3)進行取材，檢測指標。治療實驗在造模3個月后開始給予藥物治療，分別在給藥后的1月(M1)，2月(M2)和3月(M3)進行取材，檢測指標。
　　①測量大鼠空腹時體重，處死后游離大鼠子宮和雙側腎上腺進行分別稱重;
　?、谌〈笫驦1-3椎體進行離體骨密度測量;
　　③分離L2椎體進行micro-CT掃描，劃定椎體感興趣區(qū)域，并進行三維重建;
　?、躄2椎體micro-CT掃描完畢后，去除

6、其椎體后方附件及上下終板，磨平至兩端平行、約5mm高度的中心圓柱體。萬能材料試驗儀器以1mm/min速度進行壓縮試驗;
　?、萑4椎體甲醛固定后，進行脫鈣、脫水、包埋、切片處理，HE染色檢測椎體內(nèi)骨組織形態(tài)學變化;
　?、奕、葜星泻玫陌灼M行TRAP染色，評估椎體骨小梁表面破骨分化情況;
　　(2)龜板對GIOP大鼠血清AKP活性及骨轉化指標的影響
　?、偃∩鲜?1)中實驗大鼠進行腹主動脈采血，離心獲取血清，堿

7、性磷酸酶測試盒檢測血清AKP活性;
　　②ELISA檢測上述①中血清骨轉化指標PINP和β-CTX表達水平;
　　(3)龜板對大鼠椎體let-7f和Wnt/β-catenin通路相關因子的調(diào)控作用
　?、偃∩鲜?1)中實驗大鼠L5、L6，去除椎體附件、軟組織和終板軟骨，液氮保存?zhèn)溆谩?br>　?、赗T-qPCR檢測上述①中L5/6椎體中l(wèi)et-7f、TNFR2、GSK3β、β-catenin、AP-1、CTSK、MMP

8、9、OPG、Runx2、SP7的基因表達;
　?、跧HC檢測(1)中L4椎體Runx2、CTSK的蛋白表達;
　?、躓estern-blot檢測上述①中L5/6椎體中TNFR2、p-GSK3β、p-β-catenin、Runx2、CTSK蛋白表達;
　　3.細胞實驗研究
　　(1)龜板有效成分(PTE)對BMSCs的增殖和成骨分化作用
　　4周齡SD大鼠股骨或脛骨髓腔提取原代BMSCs，培養(yǎng)、傳代。CCK8

9、檢測不同濃度PTE在1、3、5、7、14、21天的增殖情況;選取最佳濃度進行成骨誘導，ALP染色和茜素紅染色檢測PTE對BMSCs成骨分化的影響;
　　(2) let-7f與TNFR2的靶向調(diào)控關系
　　構建TNFR2(TNFRSF1B)點突變載體和TNFR2(TNFRSF1B)3'UTR野生型載體，應用LipofectamineTM2000試劑將TNFRSF1B-3' UTR野生型載體、TNFRSF1B-MUT突變載體與N

10、C mimics、let-7f-5p mimics共轉染細胞，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測觀察let-7f-5p對TNFRSF1B的靶向結合作用。
　　結果:
　　1.臨床研究
　　(1)高通量測序篩查差異miRNA及其靶基因預測
　　高通量測序篩選出18個顯著差異表達的miRNA，其中2個表達上調(diào)，16個表達下調(diào)。通過在miranda、mirbase及targetscan數(shù)據(jù)庫中預測差異miRNAs靶基因，發(fā)現(xiàn)上

11、調(diào)的miRNAs在數(shù)據(jù)庫中共有靶基因488個。下調(diào)miRNA在數(shù)據(jù)庫中共有靶基因475個。此外，還發(fā)現(xiàn)3個新miRNA，分別在1號、11號和12號染色體上。
　　(2) RT-qPCR驗證高通量測序篩查的差異miRNAs，預測Wnt/β-catenin通路相關的靶基因
　　根據(jù)測序結果及原始數(shù)據(jù)標準化tag數(shù)，共選出25個miRNA進行驗證，結果顯示，hsa-miR-186-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-

12、214-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-451a五個表達顯著上調(diào)miRNAs和hsa-let-7f-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-27a-3p三個表達顯著下調(diào)miRNAs，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中l(wèi)et-7f最具顯著性，通過查詢KEGG及文獻，其靶基因TNFR2與Wnt/β-catenin通路密切相關。
　　2.動物實驗研究
　　(1)龜板對GIOP大鼠的防治作用

13、>　?、俑鹘M大鼠體重、子宮和腎上腺質(zhì)量比較
　　預防實驗中，與SHAM組比較，GIOP組在M1、M2、M3時體重、子宮和腎上腺質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05);與GIOP組比較，PT組和PT+ALN組體重、子宮和腎上腺質(zhì)量在M1、M3時均顯著升高（P＜0.05);
　　在治療實驗中，與SHAM組比較，GIOP組在M1、M2時體重及M1時腎上腺顯著降低（P＜0.01）;與GIOP比較，各治療組腎上腺質(zhì)量在M1時顯著升高(P＜0.

14、05)。
　　②各組大鼠腰椎骨密度結果比較
　　預防實驗中，與SHAM組比較，GIOP組BMD在M1、M2和M3時均明顯降低(P＜0.05)，AREA和BMC在M1和M2時明顯降低(P＜0.05); PT和PT+ALN組在M1、M2、M3時BMD、BMC或AREA顯著高于GIOP組(P＜0.05)。各治療組間無統(tǒng)計學差異。
　　治療實驗中，GIOP組的BMC和BMD均顯著低于SHAM組（P＜0.05);在M1時，與GI

15、OP組比較，各治療組AREA和BMC明顯升高(P＜0.05);在M3時，各治療組BMC和BMD均明顯高于GIOP組(P＜0.05)，PT組和ALN組AREA較GIOP組明顯升高（P＜0.05)。
　?、鄹鹘M大鼠腰椎骨微細結構比較
　　預防實驗的M3時，與SHAM組比較，GIOP組BS/TV、Tb.N、Tb.Th、vBMD均明顯降低(P＜0.05)，GIOP組SMI、Tb.Sp均明顯升高(P＜0.05);與GIOP比較，PT組

16、和PT+ALN組SMI顯著低于GIOP組(P＜0.05)，PT組Tb.Th和PT+ALN組Tb.N顯著高于GIOP組（P＜0.05)。
　　治療實驗的M3時，與SHAM組比較，GIOP組BV/TV、Tb.Th、vBMD明顯降低(P＜0.05)，SMI、Tb.Sp明顯升高(P＜0.05);與GIOP組比較，各治療組BS/TV、Tb.N、Tb.Th、vBMD均明顯升高(P＜0.05)，SMI、Tb.Sp均降低(P＜0.05)。

17、　　在預防和治療實驗中，micro-CT二維及三維重建圖均顯示，GIOP組與SHAM組比較骨微細結構嚴重破壞，各治療組較GIOP組骨微細結構明顯改善。
　?、芨鹘M大鼠腰椎骨生物力學比較
　　預防實驗的M3時，與SHAM組比較，GIOP組壓縮強度顯著降低(P＜0.05)。與GIOP組比較，PT組和PT+ALN組壓縮強度和PT組壓縮剛度明顯高于GIOP組(P＜0.05)。
　　治療實驗的M3時，與SHAM組比較，GIOP組

18、壓縮強度顯著降低(P＜0.05);與GIOP組比較，各治療組壓縮強度和能量吸收值均顯著升高(P＜0.05)。
　　⑤各組大鼠腰椎形態(tài)學改變
　　預防和治療實驗中，在不同時間點GIOP組與SHAM組比較，骨小梁有不同程度損害，表現(xiàn)為數(shù)量明顯減少、斷裂，排列紊亂，間隙明顯增寬;骨小梁表面成、破骨細胞稀疏，骨髓腔干細胞稀少，骨髓腔脂肪泡明顯增多。PT和PT+ALN組在不同時間點，骨小梁損害可獲得不同程度改善。
　?、薷鹘M大鼠

19、腰椎破骨活性比較
　　預防和治療實驗在不同時間點，與SHAM組比較，TRAP染色陽性結果提示GIOP組破骨活性較低，其中在M3表現(xiàn)更為明顯;與GIOP比較，各治療組隨著月齡的增加，其TRAP染色陽性結果提示破骨活性均顯著增加，PT組和PT+ALN組在M1、M2、M3時間點均較ALN組顯著;
　　(2)龜板對GIOP大鼠血清AKP活性及骨轉化指標的影響
　?、俑鹘M大鼠血清AKP活性結果
　　預防實驗在M1、M2時，

20、與SHAM組比較，GIOP組AKP活性明顯升高(P＜0.05);PT和PT+ALN組在M1和M2時間點顯著低于GIOP組(P＜0.05)。治療實驗中，與SHAM組比較，GIOP組在M1時間點AKP顯著升高(P＜0.05)，在M2時間點，PT+ALN組AKP活性較GIOP組、PT組和ALN組均明顯升高(P＜0.001)。
　?、诟鹘M大鼠血清PINP和β-CTX水平比較
　　預防和治療組中，GIOP組與SHAM組比較PINP和β

21、-CTX水平無統(tǒng)計學差異，但表現(xiàn)為升高趨勢;與GIOP組比較，各治療組PINP和β-CTX水平無統(tǒng)計學差異，但均呈下降趨勢。
　　(3)龜板對大鼠椎體let-7f和Wnt/β-catenin通路相關因子的調(diào)控作用
　　①RT-qPCR檢測預防實驗和治療實驗中各組椎體let-7f、TNFR2、GSK3β、β-catenin、AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、SP7的基因表達;
　　預防實驗和治療實驗在M3

22、時間點，與SHAM組比較，GIOP組let-7f、β-catenin表達顯著降低(P＜0.01)，TNFR2、GSK3β表達顯著上調(diào)(P＜0.05)，AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、和SP7表達與SHAM組無統(tǒng)計學差異，但仍有下調(diào)趨勢。PT組和PT+ALN組let-7f、β-catenin表達顯著高于GIOP組(P＜0.05)，TNFR2、GSK3β表達顯著低于GIOP組(P＜0.05)，AP-1、CTSK、MMP9、

23、OPG、Runx2、和SP7與GIOP組無統(tǒng)計學差異，但均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢。
　　②IHC檢測(1)中L4椎體Runx2、CTSK的蛋白表達;
　　預防實驗和治療實驗的M3時間點，與SHAM組比較，GIOP組Runx2表達明顯降低，CTSK表達明顯升高;與GIOP組比較，各治療組Runx2明顯增加，CTSK表達明顯降低。其中，PT+ALN組表現(xiàn)最為顯著。
　?、踂estern-blot檢測預防實驗和治療實驗中各組椎體中T

24、NFR2、p-GSK3β、p-β-catenin、Runx2、CTSK蛋白表達;
　　預防和治療實驗中均顯示，與SHAM組比較，GIOP組TNFR2和p-β-catenin表達顯著升高(P＜0.01)，p-GSK3β表達顯著降低(P＜0.001)。與GIOP組比較，PT和PT+ALN組TNFR2、p-β-catenin表達顯著降低(P＜0.05)，p-GSK3β表達顯著升高（P＜0.05）。;
　　3.細胞實驗研究
　

25、　(1)龜板有效成分(PTE)對BMSCs的增殖和成骨分化作用
　　PTE干預7天，BMSCs增殖呈劑量增加，7天后各組細胞增殖呈劑量依賴性下降，30ug/ml濃度為PTE最佳干預濃度。成骨誘導14天后，PTE干預后的ALP陽性染色明顯較強，陽性細胞數(shù)量明顯增多。茜素紅染色顯示PTE組陽性染色細胞數(shù)量明顯多于對照組。
　　(2) let-7f與TNFR2的靶向調(diào)控關系
　　在轉染野生型TNFRSF1B-3'UTR載體細

26、胞中，共轉染let-7f-5p mimics的TNFRSF1B表達較共轉染NC mimics的顯著下調(diào)（P＜0.001）;而在轉染突變型TNFRSF1B-MUT載體細胞中，共轉染let-7f-5p mimics的TNFRSF1B表達與共轉染NC mimics的無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　1.臨床研究:通過高通量測序，我們發(fā)現(xiàn)了GIOP椎體中2個表達上調(diào)miRNA和16個表達下調(diào)miRNA; RT-qPCR

27、驗證后，發(fā)現(xiàn)miR-186-5p、miR-21-5p、miR-214-5p、miR-10b-5p、miR-451a五個顯著表達上調(diào)miRNAs和let-7f-5p、let-7a-5p、miR-27a-3p三個顯著表達下調(diào)miRNAs，這八個miRNAs在GIOP發(fā)病中可能起重要調(diào)控作用;基于測序數(shù)據(jù)、驗證結果及生物信息學分析結果，通過查詢KEGG Pathway數(shù)據(jù)資源，我們預測，Let-7f-5p可能靶向TNFR2調(diào)控Wnt/β-ca

28、tenin通路是GIOP的發(fā)病機理。
　　2.動物實驗研究:
　　(1)龜板防治GIOP骨損害具有明顯效果，并與ALN聯(lián)合應用在骨量、骨微細結構、骨生物力學及骨組織形態(tài)學等方面均顯示出較好的聯(lián)合效應和優(yōu)勢;
　　(2)大鼠應用或撤退GC后，AKP活性均呈現(xiàn)先上升，后逐漸降低的趨勢;龜板和龜板聯(lián)合ALN能逆轉前期GC誘導的AKP活性升高和后期GC誘導的AKP活性降低。
　　(3)本研究證實，在GIOP大鼠腰椎中，在

29、基因?qū)用?，let-7f表達下調(diào)，其靶基因TNFR2上調(diào)，Wnt信號通路關鍵因子GSK3β上調(diào)，β-catenin下調(diào)，而在蛋白層面，TNFR2上調(diào)，p-GSK3β下調(diào)，p-β-catenin上調(diào)，從而導致游離β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)減少，最后檢測到核轉錄因子Runx2蛋白表達升高，應用龜板或龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉干預后能逆轉GC誘導的let-7f下調(diào)和Wnt/β-catenin通路的抑制。從而驗證了本研究的假說。
　　3.細胞實驗研