產(chǎn)紫杉醇真菌NK-36b的分離鑒定及高效DNA轉(zhuǎn)化方法建立.pdf

1、從柏樹枝中分離到一株內(nèi)共生真菌NK-36b，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)TLC法初步鑒定，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的遷移率(Rf值)；經(jīng)HPLC定性定量檢測(cè)，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的保留時(shí)間；經(jīng)質(zhì)譜進(jìn)一步確定，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的分子量；紫杉醇單克隆抗體實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)。
　　 對(duì)NK-36b進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，后根據(jù)真菌18S rDNA通用引物，以此菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物為1770 bp，測(cè)序結(jié)果初步鑒定到屬；PCR

2、擴(kuò)增出該菌的rDNA基因間隔區(qū)ITS，該菌ITS序列長(zhǎng)579 bp，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步鑒定該菌株到種。
　　 繪制NK-36b的生長(zhǎng)曲線及紫杉醇生產(chǎn)曲線。在200 rpm，28℃條件下，PDA液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)6 d該菌生長(zhǎng)最旺盛，菌絲產(chǎn)量最高；3 d就開始產(chǎn)生紫杉醇，10 d產(chǎn)量最高，平均產(chǎn)量是1 mg/L培養(yǎng)基。
　　 為了便于在NK－36b中進(jìn)行基因操作，建立了該菌的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tume

3、faciens)介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)化體系及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系。優(yōu)化了原生質(zhì)體實(shí)驗(yàn)條件及步驟，采用8 mg/ml蝸牛酶，1 mg/ml纖維素酶，以0.7 MNaCl為消化緩沖液，35℃靜置消化1.5 h，紗布過(guò)濾，可得到106～108/ml的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體與質(zhì)粒DNA冰上共浴30 min，以60％的PEG3350介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化子最多。繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子確定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明插入標(biāo)記基因在無(wú)選擇壓力條件下培養(yǎng)8代仍穩(wěn)定。