產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離、鑒定及生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn).pdf

1、從貴州省喀斯特地區(qū)生長(zhǎng)的數(shù)種羅漢松屬(Podocrapus)植物中采用組織塊法自羅漢松的根、莖、葉等組織中分離到155株內(nèi)生真菌。其中地上組織的內(nèi)生真菌種類與地下組織分別占83.87％，16.13％。 155株內(nèi)生真菌經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，采用抽提法抽提內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物，通過(guò)杯碟法檢測(cè)其抑菌活性，顯示有47株(30.3％)內(nèi)生真菌有較高的抑菌活性。其中6株(3.87％)內(nèi)生真菌粗提物在稀釋102倍后仍表現(xiàn)出顯著抑菌活性；另有5株(3

2、.23％)內(nèi)生真菌對(duì)三種受試菌株均有抗性。 同樣采用抽提法抽提經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)155株內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物，選取Vero、BHK-21細(xì)胞應(yīng)用(MethylThiazolylTetrazolium，MTT)四唑藍(lán)比色法對(duì)抽提內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的活性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示28株內(nèi)生真菌有較高的抑癌活性。對(duì)28株抗腫瘤內(nèi)生真菌進(jìn)行的薄層層析(TainLayerChromatography，TLC)和高效液相色譜(HighPerform

3、anceLiquidChromatography,HPLC)分析結(jié)果證明，菌株A2為羅漢松產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，將其命名為EPTP-1。 對(duì)EPTP-1進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，EPTP-1的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)符合曲霉屬的分類特征。CTAB法提取EPTP-1菌株全基因組，對(duì)其核糖體基因居間序列(ITS)進(jìn)行Blastn分析，Mega4.0建系統(tǒng)樹后顯示與煙曲霉同源性99％。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子分類學(xué)分析鑒定EPTP-1菌株為煙曲霉(Aspergi

4、llus.fumigatus)。 對(duì)EPTP-1在PDB培養(yǎng)基中不同時(shí)間段的紫杉醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明培養(yǎng)第5dEPTP-1產(chǎn)紫杉醇的得率最高，紫杉醇產(chǎn)率為0.5578±0.0294mg/L。 將EPTP-1菌株的粗提物進(jìn)行刮板法純化紫杉醇得到紫杉醇粗純品，采用熒光染色法(AO/EB)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析，證實(shí)所產(chǎn)紫杉醇的活性與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品一致：濃度為10μg/L~103μg/L的紫杉醇粗純品作用24h.就有明顯的致Ver