骨橋蛋白及B細(xì)胞刺激因子在母-胎界面的表達(dá)及生物學(xué)意義.pdf

1、第一部分骨橋蛋白在母胎界面的表達(dá)及與uNK細(xì)胞選擇性聚集關(guān)系的研究 目的：研究骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)在人正常妊娠早期和不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)(unexplmned recurrent spontaneous abortion，URSA)患者母胎界面組織中的表達(dá)及蛻膜組織中CD56+NK細(xì)胞的聚集情況；分析蛻膜組織中OPN的表達(dá)與CD56+NK細(xì)胞募集之間的相關(guān)性；并觀察人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN的表達(dá)及孕

2、酮對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；探討OPN表達(dá)在URSA發(fā)病中可能的作用。 方法：(1)選擇2005年1月-2006年10月來(lái)齊魯醫(yī)院計(jì)劃生育科就診的妊娠4-10周的正常妊娠人工流產(chǎn)婦女及不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)患者各45例，分別按妊娠周數(shù)分為3組(組1:4-56/7w;組2:6-76/7w；組3:8-10w；n=15/每組)，無(wú)菌條件下分離其絨毛及蛻膜組織。(2)RT-PCR、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同孕周正常妊娠早期和不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)患

3、者蛻膜及絨毛組織中OPN的表達(dá)情況。(3)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同孕周正常妊娠早期和不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中CD56+NK細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化情況。(4)Spearman等級(jí)相關(guān)法分析蛻膜組織中OPN表達(dá)與CD56+NK細(xì)胞募集之間的相關(guān)性。(5)選擇正常妊娠4-10周行人工流產(chǎn)術(shù)的婦女5例，無(wú)菌收集蛻膜組織，采用酶消化法對(duì)新鮮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離及培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)。(6)傳代后的細(xì)胞分別接種在

4、放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，對(duì)傳代后的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分組，用5×10-7mol/L的黃體酮作用48、72、96小時(shí)，采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)黃體酮對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN表達(dá)的影響。 結(jié)果：(1)RT-PCR結(jié)果顯示正常妊娠早期和不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)患者的蛻膜及絨毛組織中都能檢測(cè)到OPN的表達(dá)：但是OPN在URSA患者蛻膜及絨毛組織中的表達(dá)水平顯著低于正常妊娠組(P＜0.05)；在正常妊娠早期隨著孕周的增加

5、，OPN在蛻膜及絨毛組織中的表達(dá)呈升高趨勢(shì)(P＜0.05)。(2)免疫組化染色結(jié)果顯示在蛻膜及絨毛組織中，OPN主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi)胞核周圍，陽(yáng)性細(xì)胞呈局灶或彌漫性分布；在子宮蛻膜組織中的上皮細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá)，尤以蛻膜基質(zhì)細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)最強(qiáng)；在絨毛組織的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)、合體滋養(yǎng)細(xì)胞層弱表達(dá)或不表達(dá)；但是在URSA患者蛻膜及絨毛組織中OPN蛋白的表達(dá)均低于正常妊娠組(P＜0.05)。(3)蛻膜組織中CD56+NK細(xì)

6、胞的免疫組化染色結(jié)果顯示：CD56+NK細(xì)胞局灶性或彌漫性的分布在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中間；與相同孕周的正常妊娠組相比，CD56+NK細(xì)胞在URSA組患者蛻膜組織中的表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)；正常早孕期間，隨著妊娠周數(shù)的增加，CD56+NK細(xì)胞的數(shù)量呈增加趨勢(shì)(P＜0.05)。(4)Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示：蛻膜組織中OPN的表達(dá)與CD56+NK細(xì)胞的聚集呈正相關(guān)(rs=0.87，P＜0.05)。(5)消化后的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在接種

7、過(guò)夜后大部分已貼壁；貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞為纖維母細(xì)胞狀，呈較細(xì)長(zhǎng)的梭形或不規(guī)則的星形，核呈卵圓形，一般培養(yǎng)5-7天后細(xì)胞融合成單層。波形蛋白免疫組化結(jié)果顯示體外培養(yǎng)傳代后的細(xì)胞95％以上為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。 (6)5×10-7mol/L的黃體酮對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN表達(dá)的刺激作用存在作用時(shí)間依賴性，藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，OPN表達(dá)越強(qiáng)；對(duì)照組基質(zhì)細(xì)胞中OPN的表達(dá)不隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。 結(jié)論：(1)OPN與正常妊娠維持中的胚胎植入、胎盤形成

8、有關(guān)，人妊娠早期母胎界面OPN的表達(dá)異常與URSA的發(fā)生有關(guān)。(2)蛻膜組織中OPN的表達(dá)對(duì)組織中CD56+NK細(xì)胞的募集起調(diào)控作用，與正常妊娠的維持密切相關(guān)。(3)黃體酮調(diào)控蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN的表達(dá)，提示孕激素參與妊娠早期母胎界面OPN表達(dá)的調(diào)控及uNK細(xì)胞的聚集。 第二部分B細(xì)胞刺激因子在母胎界面的表達(dá)及其生物學(xué)意義研究 目的：研究B細(xì)胞刺激因子(B cell-activating factor of TNF fa

9、mily,BAFF)在正常早孕人工流產(chǎn)婦女和不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)(unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA)患者母胎界面組織中的表達(dá)，探討B(tài)AFF在URSA發(fā)病中的生物學(xué)意義。 方法：(1)選擇2005年1月.2006年10月來(lái)齊魯醫(yī)院計(jì)劃生育科就診的妊娠4-10周的正常早孕人工流產(chǎn)婦女及不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)患者各45例，分別按妊娠周數(shù)分為3組(組1:4-56/7w；組2:

10、6-76/7w；組3:8-10w；n=15/每組)，無(wú)菌條件下分離其絨毛及蛻膜組織。 (2)分別提取不同孕周正常妊娠早期和不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)患者蛻膜及絨毛組織中的總RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western blotting技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)絨毛組織及蛻膜組織中BAFF及BAFF受體(BAFF-R)的表達(dá)。(3)將獲取的新鮮絨毛和蛻膜組織用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)BAFF蛋白在早

11、孕人工流產(chǎn)婦女及不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)分布。 結(jié)果： (1)RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示正常早孕人工流產(chǎn)婦女及不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)患者的蛻膜及絨毛組織中都有BAFF的表達(dá)；但是在相同孕周的情況下，BAFF在URSA患者蛻膜及絨毛組織中的表達(dá)水平均弱于正常妊娠組(P＜0.05)。 (2)在正常早孕人工流產(chǎn)婦女及不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)患者的標(biāo)本中皆未檢測(cè)到BAFF-R的表達(dá)。 (

12、3)免疫組化染色結(jié)果顯示BAFF蛋白在全部標(biāo)本絨毛組織中的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞層均表達(dá)；但在URSA患者絨毛組織中的表達(dá)弱于正常妊娠組。BAFF蛋白在正常早孕人工流產(chǎn)婦女蛻膜組織的基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在URSA患者蛻膜組織中基質(zhì)細(xì)胞中亦有表達(dá)，但表達(dá)水平明顯低于正常早孕人工流產(chǎn)婦女，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中則未見(jiàn)其表達(dá)。 結(jié)論：BAFF作為一種非凋亡誘導(dǎo)的、胎盤起源的TNF超家族細(xì)胞因子，在胚泡植入和早期妊娠的維持中起