PPARγ蛋白的體液表達(dá)及其對(duì)母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、第一部分 PPARγ蛋白在GDM孕婦及正常妊娠孕婦外周血、新生兒臍血及羊水中的表達(dá)
　　目的:通過(guò)檢測(cè)GDM孕婦及正常妊娠孕婦外周血、新生兒臍血及羊水中PPARγ蛋白的表達(dá)，了解PPARγ是否在人體液組織內(nèi)表達(dá)，并比較其在GDM孕婦與正常妊娠孕婦的體外表達(dá)有無(wú)差異。
　　方法:選取在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科2012年10-11月足月妊娠行選擇性剖宮產(chǎn)的GDM孕婦和正常妊娠孕婦各30例，孕38-41周期間選擇性剖宮產(chǎn)手術(shù)時(shí)采

2、集孕婦外周血、新生兒臍血及羊水。ELLSA方法檢測(cè)GDM孕婦及正常妊娠孕婦外周血、新生兒臍血及羊水中PPARγ蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:GDM足月妊娠孕婦血漿中PPARγ蛋白濃度(0.201 ng/ml)高于正常足月孕婦血漿中PPARγ蛋白濃度（0.153ng/ml），其差異有顯著性(P＜0.001)。GDM足月妊娠新生兒臍帶血漿及羊水中PPARγ蛋白濃度與正常足月孕婦新生兒臍帶血漿及羊水中PPARγ蛋白濃度，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3、　　結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ蛋白在細(xì)胞外液即人體液組織中的表達(dá)，我們推測(cè)PPARγ可能通過(guò)一定的機(jī)制由細(xì)胞內(nèi)釋放至細(xì)胞外，并且為了維持胎兒體內(nèi)及羊水中PPARγ蛋白的穩(wěn)態(tài)，GDM孕婦外周血的PPARγ蛋白反應(yīng)性的增高，但PPARγ蛋白影響母胎界面細(xì)胞功能需要進(jìn)一步研究。
　　第二部分 PPARγ蛋白在GDM孕婦胎盤(pán)、羊膜、絨毛膜的定位
　　目的:通過(guò)分析GDM孕婦胎盤(pán)、羊膜、絨毛膜上PPARγ蛋白的

4、定位表達(dá)，了解PPARγ蛋白在母胎界面可能的功能。
　　方法:選取在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科2012年10-11月足月妊娠行選擇性剖宮產(chǎn)的GDM孕婦的胎盤(pán)、羊膜、絨毛膜組織各5例。免疫組化方法檢測(cè)PPARγ蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:在GDM孕婦的胎盤(pán)組織中，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)，主要表達(dá)在合體滋養(yǎng)細(xì)胞核，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞未見(jiàn)明顯表達(dá)。在GDM孕婦羊膜組織中，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)主要位于羊膜上皮層中的單層立方上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)、

5、成纖維細(xì)胞層中的成纖維細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)及無(wú)定形基質(zhì)內(nèi)。在GDM孕婦絨毛膜組織中，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)主要位于網(wǎng)狀層的細(xì)胞的細(xì)胞膜上及成纖維細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)。
　　結(jié)論:在胎盤(pán)層面，PPARγ蛋白定位于胎盤(pán)的合體滋養(yǎng)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，可見(jiàn)PPARγ蛋白不僅定位于細(xì)胞核內(nèi)，有可能通過(guò)細(xì)胞損傷分泌到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外的可能，進(jìn)一步支持了臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程中臍血血漿、羊水中檢測(cè)到PPARγ蛋白的表達(dá)。在羊膜、絨毛膜層面，PPARγ蛋白定位于羊膜上皮細(xì)胞核

6、、無(wú)定型基質(zhì)內(nèi)及絨毛膜網(wǎng)狀層細(xì)胞的細(xì)胞膜上，進(jìn)一步支持了胎膜的分泌功能，有可能PPARγ蛋白通過(guò)胎膜的分泌功能分泌進(jìn)入羊水。由此可見(jiàn)PPARγ蛋白可能通過(guò)內(nèi)分泌分泌到外周循環(huán)，進(jìn)而發(fā)揮作用。
　　第三部分 PPARγ蛋白對(duì)細(xì)胞糖、脂代謝能力的影響
　　目的:建立滋養(yǎng)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的體外誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系，模擬母胎界面細(xì)胞間的相互作用，通過(guò)改變PPARγ蛋白在共培養(yǎng)體系中的濃度，分析滋養(yǎng)細(xì)胞合體化相關(guān)分子、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)

7、胞容受性相關(guān)分子以及兩種細(xì)胞糖、脂代謝能力的改變，進(jìn)一步了解PPARγ是否發(fā)揮母胎細(xì)胞交互作用的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)作用是否影響細(xì)胞的糖、脂代謝功能的改變。
　　方法:采用人絨癌滋養(yǎng)細(xì)胞株（BeWo細(xì)胞）及子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESC細(xì)胞）建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入純化的PPARγ蛋白，改變細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中游離PPARγ蛋白的濃度，分別設(shè)立PPARγ蛋白濃度為0.25ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL。RT-PCR方

8、法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUT1)、硬脂酰CoA去飽和酶(SCD)的表達(dá)，檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞合體化分子syncytin的表達(dá)，檢測(cè)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞容受性相關(guān)分子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。油紅O染色法觀察共培養(yǎng)體系中BeWo細(xì)胞和ESC細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的儲(chǔ)存能力改變。
　　結(jié)果:1）BeWo細(xì)胞GLUT1 mRNA、SCD mRNA的表達(dá):單獨(dú)培養(yǎng)體系中，在各濃度PPARγ作用下，BeWo細(xì)胞表達(dá)Glut1 mRNA、SCD mR

9、NA相對(duì)表達(dá)率均無(wú)差異性。在共培養(yǎng)體系中，在PPARγ蛋白濃度為10ng/ml、5ng/ml時(shí)，BeWo細(xì)胞表達(dá)Glut1 mRNA相對(duì)表達(dá)率相對(duì)空白對(duì)照組有顯著性增高(P＜0.05)，SCD mRNA相對(duì)表達(dá)率隨著PPARγ蛋白增加有一定增高趨勢(shì)，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。共培養(yǎng)體系相對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)體系BeWo細(xì)胞Glut1 mRNA、SCD mRNA相對(duì)表達(dá)率數(shù)值上有一定升高，僅在PPARγ蛋白濃度為10ng/m，SCD mRNA相對(duì)表達(dá)率的升

10、高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2) ESC細(xì)胞中GLUT1 mRNA、 SCD mRNA的表達(dá):單獨(dú)培養(yǎng)體系、共培養(yǎng)體系中ESC細(xì)胞表達(dá)Glut1 mRNA、SCD mRNA無(wú)差異性。
　　3) BeWo細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲(chǔ)存能力:在共培養(yǎng)體系中，隨著蛋白濃度的調(diào)高，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，BeWo細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量增多，PPARγ蛋白的濃度為10ng/ml的時(shí)候，BeWo細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量明顯增多。
　　4) ESC細(xì)胞內(nèi)脂

11、質(zhì)儲(chǔ)存能力:在共培養(yǎng)體系中，隨著蛋白濃度的調(diào)高，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，ESC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量增多，PPARγ蛋白的濃度為10ng/ml的時(shí)候，ESC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪的含量明顯增多。
　　5) BeWo細(xì)胞合體化相關(guān)因子的表達(dá):單獨(dú)培養(yǎng)體系中，隨著蛋白濃度的調(diào)高，RT-PCR檢測(cè)BeWo細(xì)胞表達(dá)Syncytin mRNA有一定增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。共培養(yǎng)體系中，Syncytin mRNA的相對(duì)表達(dá)率隨著蛋白濃度的調(diào)高，沒(méi)有趨向性。6)

12、ESC細(xì)胞容受性相關(guān)因子的表達(dá):單獨(dú)培養(yǎng)體系、共培養(yǎng)體系中ESC細(xì)胞表達(dá)VEGF mRNA無(wú)差異性。
　　結(jié)論:在BeWo細(xì)胞和ESC細(xì)胞糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的研究發(fā)現(xiàn)，僅在共培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)PPARγ蛋白濃度為5ng/ml、10ng/ml時(shí)，BeWo細(xì)胞表達(dá)Glut1 mRNA相對(duì)表達(dá)率相對(duì)空白對(duì)照組有顯著性增高，且共培養(yǎng)體系相對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)體系中Glut1mRNA、SCD mRNA相對(duì)表達(dá)率有升高趨勢(shì)，PPARγ蛋白濃度為10ng/ml時(shí)

13、，SCDmRNA相對(duì)表達(dá)率的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有可能PPARγ蛋白依靠BeWo細(xì)胞和ESC細(xì)胞之間的相互影響發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝的作用。油紅O染色發(fā)現(xiàn)BeWo細(xì)胞和ESC細(xì)胞內(nèi)脂滴的累積隨著PPARγ蛋白的濃度的增高有一定增加，隨著PPARγ蛋白的濃度的增高，BeWo細(xì)胞和ESC細(xì)胞對(duì)于脂肪的儲(chǔ)存能力明顯提高，表明PPARγ蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞改善細(xì)胞脂肪代謝，有可能可以改善外周循環(huán)中高血脂的情況。
　　BeWo細(xì)胞合體化因子syncy

14、tin的分泌在單獨(dú)培養(yǎng)體系梯形增加，且光鏡下BeWo細(xì)胞合體化增加，表明PPARγ蛋白作用于BeWo細(xì)胞，一定程度上促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞的合體化，但其量的積累尚未達(dá)到質(zhì)的變化，因此雖未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍表明在PPARγ蛋白作用下BeWo細(xì)胞的合體化仍處于較好的狀態(tài)，未出現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞融合異常。而在共培養(yǎng)體系隨著PPARγ蛋白濃度的增高，BeWo細(xì)胞表達(dá)Syncytin mRNA水平無(wú)差異，表明有可能在ESC細(xì)胞的影響，BeWo細(xì)胞融合異常。ESC

15、細(xì)胞的VEGF mRNA表達(dá)率，未隨著PPARγ蛋白濃度的增高而發(fā)生變化，說(shuō)明細(xì)胞外液的PPARγ可能對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的容受性無(wú)明顯影響。
　　綜上所述，可見(jiàn)PPARγ蛋白促進(jìn)共培養(yǎng)體系中滋養(yǎng)細(xì)胞糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GULT1和脂代謝蛋白SCD的表達(dá)，并促進(jìn)共培養(yǎng)體系兩種細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取，而對(duì)兩種細(xì)胞合體化分子Syncytin和容受性分子VEGF無(wú)明顯影響，推測(cè)細(xì)胞外液的PPARγ蛋白可能影響了母胎界面細(xì)胞的糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)功能，可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的