嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞生物學(xué)特性的體外研究.pdf

1、目的：建立體外分離培養(yǎng)嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞的方法,優(yōu)化嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)條件,誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元,為嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞或多巴胺能神經(jīng)元移植治療帕金森病提供初步的基礎(chǔ)研究資料。建立體外分離純化嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的方法,從神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)角度鑒定其生物學(xué)特性,論證嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞作為輔助細(xì)胞進(jìn)行移植治療的可能性。
　　 方法：⑴自成年大鼠鼻中隔活體剪取部分鼻粘膜制成細(xì)胞懸液,以含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后

2、換為含生長(zhǎng)因子的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),動(dòng)態(tài)觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程。以免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的表達(dá)。⑵應(yīng)用2％瓊脂糖懸浮培養(yǎng)傳代嗅黏膜神經(jīng)球,在免疫熒光染色法和免疫印跡的輔助下,研究傳代培養(yǎng)神經(jīng)球的生物學(xué)特性。⑶以神經(jīng)生長(zhǎng)因子、全反式維甲酸和音猬因子誘導(dǎo)嗅黏膜神經(jīng)球分化,鑒定分化細(xì)胞中酪氨酸羥化酶的表達(dá),確認(rèn)其為多巴胺能神經(jīng)元。⑷自成年大鼠鼻中隔獲取嗅黏膜,制成細(xì)胞懸液,以完全培養(yǎng)基體外培養(yǎng),三次應(yīng)用差速

3、貼壁法純化混合細(xì)胞中的嗅鞘細(xì)胞,對(duì)嗅鞘細(xì)胞的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定。⑸以免疫熒光染色法和免疫印跡比較第1代和第10代嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、神經(jīng)肽Y和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①嗅黏膜混合細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后,首先貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞大多為扁平多邊形細(xì)胞,此后可見散在的球形細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)3天更換成神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基,貼壁細(xì)胞中出現(xiàn)大量的圓球形細(xì)胞,該細(xì)胞有聚集生長(zhǎng)的特點(diǎn)。大約培養(yǎng)7天后出現(xiàn)半貼壁的神經(jīng)球,呈鳥巢狀。免疫熒光染

4、色發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞中存在較多的Nestin和CD133染色陽性的圓形細(xì)胞,Nestin主要分布于該細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),CD133主要分布于細(xì)胞膜,半貼壁的神經(jīng)球也陽性表達(dá)Nestin和CD133。②以2％瓊脂糖懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞以神經(jīng)球的方式旺盛增殖,傳代后的神經(jīng)球形態(tài)規(guī)則,大小較均勻,界限明顯。免疫熒光染色和免疫印跡均證明懸浮培養(yǎng)的第4代神經(jīng)球經(jīng)6小時(shí)快速貼壁后,仍然陽性表達(dá)Nestin和CD133。③使用含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液作用貼壁的神經(jīng)干細(xì)

5、胞24小時(shí)后,部分細(xì)胞向四周發(fā)出細(xì)長(zhǎng)的突起,突起之間相互交織成網(wǎng)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),這些多突起細(xì)胞的胞體和細(xì)長(zhǎng)突起均含神經(jīng)絲和酪氨酸羥化酶,免疫印跡也證明了這一點(diǎn)。④體外擴(kuò)增經(jīng)過三次差速貼壁純化的嗅鞘細(xì)胞,可得到大量梭形雙極細(xì)胞,細(xì)胞排列規(guī)則,形態(tài)一致,呈魚群樣。免疫熒光染色顯示,第1代和第10代的嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞均陽性表達(dá)GFAP、S-100和p75NTR,且兩代細(xì)胞間無差異。⑤第1代嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞與第10代嗅鞘細(xì)胞均能表達(dá)各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)

6、素、神經(jīng)肽Y和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,且各因子第1代的表達(dá)水平均高于第10代。
　　 結(jié)論：⑴通過大鼠嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離與篩選實(shí)驗(yàn),我們從嗅黏膜中獲得了陽性表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞分子標(biāo)志的半貼壁神經(jīng)球。這些神經(jīng)球可以通過特殊的瓊脂糖懸浮培養(yǎng)法在傳代過程中得到不斷擴(kuò)增。⑵源于嗅黏膜的神經(jīng)球能夠被誘導(dǎo)分化為TH陽性的神經(jīng)元,證明嗅黏膜來源的神經(jīng)干細(xì)胞能夠在體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元。⑶以完全培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)嗅黏膜能獲得復(fù)雜的細(xì)胞群體,