嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜色素變性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP）是最一種最常見(jiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，也是主要的致盲性疾病，目前臨床尚無(wú)有效的治療辦法。在目前研究治療視網(wǎng)膜變性疾病的方法中，細(xì)胞移植被認(rèn)為是最有潛力的治療手段。在帕金森等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中，嗅鞘細(xì)胞（OECs）與神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）表現(xiàn)出較單一移植一種細(xì)胞更好的功能修復(fù)作用。視網(wǎng)膜色度變性與神經(jīng)系統(tǒng)變性過(guò)程有許多相似性之處。在本研究中，我們以 RCS

2、變性大鼠為模型，研究OECs+NSCs聯(lián)合移植能否更好的恢復(fù)變性視網(wǎng)膜的視功能，為將來(lái)治療視網(wǎng)膜變性疾病探尋一條可行的治療途徑。
　　方法：
　　1.建立 Transwell體外共培養(yǎng)體系以模擬視網(wǎng)膜下腔環(huán)境，探究 OECs對(duì)NSCs遷徙能力的影響。
　　2.建立Transwell體外共培養(yǎng)體系，探究在有血清環(huán)境中OECs對(duì)NSCs和定向分化命運(yùn)的影響。
　　3. OEC+NSC聯(lián)合移植緩解視網(wǎng)膜色變性進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)

3、研究
　?。?）原代分離、培養(yǎng)OECs和NSCs，觀察并鑒定細(xì)胞生物學(xué)特性。
　?。?）選取28天齡（P28d）的RCS變性鼠行視網(wǎng)膜下腔細(xì)胞聯(lián)合移植，分別于移植后4周（P63d）、8周（P63d）、12周（P119d）進(jìn)行以下檢測(cè)：暗適應(yīng)F-ERG、外核層厚度測(cè)量、移植后視網(wǎng)膜組織免疫熒光檢測(cè)和Western Blot定量蛋白分析。
　　結(jié)果：
　　1.體外共培養(yǎng)體系研究OECs對(duì)NSCs遷徙能力和定向分化命運(yùn)

4、的影響。
　?。?）在離體模擬視網(wǎng)膜下腔環(huán)境中，OECs+NSCs聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組在視網(wǎng)膜內(nèi)廣泛遷移，對(duì)照組NSCs停留在移植原處。表明OECs能有效增強(qiáng)NSCs的遷移能力。
　　（2）在有血清共培養(yǎng)體系中，與OECs共培養(yǎng)后NSCs的Pax6、Sox2陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組，GFAP表達(dá)低于對(duì)照組；Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率和對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示，OECs促進(jìn)NSCs向神經(jīng)前體細(xì)胞方向分化，抑制其向膠質(zhì)前體細(xì)胞方向分化；OECs

5、對(duì)NSCs的增殖未見(jiàn)明顯影響。
　　2. OECs+NSCs聯(lián)合移植增強(qiáng)緩解視網(wǎng)膜色變性進(jìn)程的作用
　　（1）移植的OECs、NSCs均可在RCS變性大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活至術(shù)后12w（P119d）；移植細(xì)胞可在視網(wǎng)膜下腔和視網(wǎng)膜內(nèi)層遷徙，在術(shù)后8w時(shí) OECs能夠幫助NSCs在視網(wǎng)膜下腔遷徙，為改善RCS變性大鼠的視功能奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）OECs+NSCs聯(lián)合移植挽救RCS變性大鼠視功能：
　　a. OECs+

6、NSCs聯(lián)合移植組在術(shù)后4w（P63d）時(shí)暗適應(yīng)F-ERG的b波幅值相對(duì)于其他組顯著增高。
　　b.外核層厚度測(cè)量結(jié)果顯示在術(shù)后4w（P63d）至12w（P119d）OECs+NSCs聯(lián)合移植組外核層細(xì)胞均顯著增厚。
　?。?） OECs+NSCs聯(lián)合移植挽救RCS變性大鼠視功能可能的機(jī)制：
　　a. OECs+NSCs聯(lián)合后視網(wǎng)膜內(nèi)核層及以內(nèi)的Sox2陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，這種優(yōu)勢(shì)一直持續(xù)到術(shù)后8w（P91d）。

7、　　b.術(shù)后各細(xì)胞移植組未查見(jiàn)有DiI和Recoverin雙標(biāo)的細(xì)胞，說(shuō)明到移植的OECs或NSCs未能有效轉(zhuǎn)化為感光前體細(xì)胞。
　　c.單獨(dú)OECs移植組和單獨(dú)NSCs移植組分別于術(shù)后4w（P63d）和術(shù)后8w（P91d）先后表現(xiàn)顯著的抑制 Müller細(xì)胞膠質(zhì)化的作用，相應(yīng)的 WB顯示GFAP表達(dá)量降低。OECs+NSCs聯(lián)合移植組Müller細(xì)胞膠質(zhì)化情況及GFAP表達(dá)量介于二者之間。
　　結(jié)論：
　　1.本次研

8、究成功的設(shè)計(jì)了兩種Transwell共培養(yǎng)體系，揭示了：在模擬視網(wǎng)膜下腔環(huán)境中，OECs能有效增強(qiáng)NSCs的遷移能力；在有血清共培養(yǎng)體系中， OECs促進(jìn)NSCs向神經(jīng)前體細(xì)胞方向分化，抑制其向膠質(zhì)前體細(xì)胞方向分化。為在體聯(lián)合移植OECs和NSCs治療視網(wǎng)膜變性大鼠提供了依據(jù)。
　　2.本課題率先進(jìn)行了OECs和NSCs聯(lián)合移植治療RCS變性大鼠的研究。并證實(shí)聯(lián)合移植的OECs和NSCs均可在RCS變性大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活至少到12w