維生素A對(duì)體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞的一種，目前研究的間充質(zhì)干細(xì)胞大多來(lái)源于人或動(dòng)物的成體組織中。近幾年臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以其豐富的來(lái)源、方便的取材、對(duì)供體無(wú)不良影響、無(wú)倫理限制等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為了研究的熱點(diǎn)。此外，維生素A促進(jìn)多種細(xì)胞體外增殖的作用已有報(bào)道。本試驗(yàn)擬從人臍帶組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞，采用免疫組化及RT-PCR檢測(cè)其相關(guān)標(biāo)志基因、細(xì)胞凋亡基因和部分細(xì)胞因子生成能力，分析維生素A對(duì)體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。試驗(yàn)獲得如下結(jié)果:

2、
　　人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　通過(guò)酶消化法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示:(1)0.1％Ⅳ型膠原酶、0.1％Dnase酶、0.1％透明質(zhì)酸酶聯(lián)合4℃消化過(guò)夜后用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA，37℃消化25min為獲得人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞的最適條件。(2)人臍帶組織經(jīng)組合酶消化后，呈圓形或橢圓形懸浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1-2天后細(xì)胞完全貼壁，成不規(guī)則的成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)。(3)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲

3、線呈S型，2d后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6d后開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期。(4)凍存前細(xì)胞活率為90.23％，復(fù)蘇后的細(xì)胞活率為87.61％。(5)免疫組化結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因CD29、CD44、CD105，干細(xì)胞標(biāo)記基因Oct4、Nanog、Sox2，不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記基因CD31和造血干細(xì)胞標(biāo)記基因CD34。
　　上述結(jié)果表明，試驗(yàn)培養(yǎng)所得細(xì)胞可初步鑒定為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且符合進(jìn)一步試驗(yàn)要求。
　　2、維生素A對(duì)人臍

4、帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響
　　分別在FBS+DMEM/F12和KSR+DMEM/F12的培養(yǎng)中添加濃度為1μmol/L維生素A，分析維生素A對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如下:(1) MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，添加維生素A培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖加快。(2) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在添加維生素A培養(yǎng)后，細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記基因Nanog上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞增殖基因PCNA、C-myc上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞凋亡基因Bcl-x下調(diào)表達(dá)。(3)免疫組化及R

5、T-PCR檢測(cè)顯示，添加維生素A培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20代后，細(xì)胞仍表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因CD29、CD44、CD105，干細(xì)胞標(biāo)記基因Oct4、Nanog、Sox2，不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記基因CD31和造血干細(xì)胞標(biāo)記基因CD34。
　　上述結(jié)果表明，濃度為1μmol/L的維生素A可能通過(guò)上調(diào)Nanog基因的上調(diào)表達(dá)激活細(xì)胞增殖通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖基因PCNA、C-myc和細(xì)胞凋亡基因Bcl-x的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。<

6、br>　　3、維生素A對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的影響
　　分別在FBS+DMEM/F12和KSR+DMEM/F12的培養(yǎng)基中添加濃度為1μmol/L的維生素A，對(duì)4組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)量和蛋白的分泌量進(jìn)行檢測(cè)。(1) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子基因LIF、SCF、CSF1、EGF和bFGF?；駿GF在KSR組中的表達(dá)量顯著高于FBS組，基因SCF在添加維生素A組的表達(dá)