結(jié)直腸癌中EHD2、PDLIM7表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，目前居于第4位。在我國(guó)大城市中，結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)以每年4％的增長(zhǎng)速度上升。由于人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，平均壽命的提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率還有進(jìn)一步上升的可能。結(jié)直腸癌在全世界每年新發(fā)病120萬(wàn)例，確診后，患者的5年存活率僅55％。
　　 造成這種現(xiàn)狀的原因主要有3個(gè):1、結(jié)直腸癌的病因不明確，因

2、此無(wú)法做到有效的一級(jí)預(yù)防;2、缺乏便捷、高效的診斷方法，這種情況使腫瘤的二級(jí)預(yù)防成為空談;3、治療手段雖多，但總體療效不理想，且治療過(guò)程中的副作用給患者帶來(lái)的痛苦遠(yuǎn)大于其益處。因此，對(duì)結(jié)直腸的研究，無(wú)論是病因還是篩查、早期診斷，或是治療方式方法，都有可能使現(xiàn)患病者和高危人群以及其他潛在患者受益。
　　 目前結(jié)直腸癌常用的診斷方法有:1、內(nèi)鏡檢查，如纖維結(jié)腸鏡、電子結(jié)腸鏡;2、血清學(xué)檢查，多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè);3、影像學(xué)檢查，如C

3、T、MRI、胃腸道鋇餐造影、TRUS(經(jīng)直腸超聲檢查)等;4、其他檢查，如基因?qū)W檢查。以上各種方法均不同程度地存在病人依從性差、特異度和檢測(cè)靈敏度不高等問(wèn)題。在治療方面，除了對(duì)已有治療手段的不斷改進(jìn)，新藥的開(kāi)發(fā)，尤其是靶向藥物的開(kāi)發(fā)也取得了豐碩的成果。此外，對(duì)結(jié)直腸癌治療的認(rèn)識(shí)也發(fā)生了轉(zhuǎn)變，個(gè)體化治療為越來(lái)越多的人接受并得到前所未有的重視，它的基礎(chǔ)是明確的靶點(diǎn)和有效的療效預(yù)測(cè)蛋白。
　　 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)，尤其是疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的不

4、斷發(fā)展，大量的疾病差異蛋白被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)后續(xù)研究，從中遴選出疾病的診斷、分子治療及其預(yù)后判斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步離不開(kāi)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù)功能強(qiáng)大，能同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行相對(duì)和絕對(duì)定量研究。多維液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)合iTRAQ技術(shù)能得到完整的疾病蛋白質(zhì)

5、組，并能定量其中的蛋白。本研究旨在應(yīng)用這種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)正常結(jié)直腸粘膜及結(jié)直腸癌腫瘤組織進(jìn)行分析，鑒定并驗(yàn)證得到對(duì)結(jié)直腸癌有診斷或治療意義的分子標(biāo)志物。
　　 方法:
　　 1、研究對(duì)象
　　 5例結(jié)直腸癌患者的正常結(jié)直腸粘膜及結(jié)直腸腫瘤組織。
　　 2、組織標(biāo)本的收集
　　 (1)新鮮組織標(biāo)本的收集:在手術(shù)中，標(biāo)本離體后30分鐘內(nèi)收集新鮮組織標(biāo)本，深低溫保存;
　　 (2)石蠟組

6、織標(biāo)本的收集:組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定后制成蠟塊以備檢測(cè)。
　　 3、iTRAQ聯(lián)合LC/MS鑒定結(jié)直腸癌腫瘤組織與正常結(jié)直腸粘膜差異蛋白
　　 分別將5例正常粘膜樣本蛋白及5例腫瘤組織樣本蛋白混合，經(jīng)胰酶消化以后，用iTRAQ定量試劑盒分別標(biāo)記上述兩種組織蛋白。首先用強(qiáng)陽(yáng)離子交換對(duì)上述蛋白混合物進(jìn)行第一維分離，根據(jù)峰型和時(shí)間共收取20個(gè)梯度;然后采用反相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)上述樣品進(jìn)行第二維分離，據(jù)此采集多肽質(zhì)譜圖并對(duì)蛋

7、白質(zhì)進(jìn)行定量;經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，描繪出結(jié)直腸癌組織差異蛋白質(zhì)譜。結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和功能并篩選出目的蛋白。
　　 4、免疫組化檢測(cè)目的蛋白在組織中的亞細(xì)胞定位
　　 以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其表達(dá)水平。收集58例結(jié)直腸癌腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常粘膜組織，經(jīng)福爾馬林固定后，行石蠟包埋，然后切片。組織切片經(jīng)脫蠟至水、高壓修復(fù)抗原、雙氧水封閉內(nèi)源性酶后，順序孵育一抗、二抗;然后用DAB顯色、再經(jīng)過(guò)蘇木素復(fù)染。采用雙

8、盲法由兩位病理學(xué)醫(yī)師對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷。診斷標(biāo)準(zhǔn):在5個(gè)視野觀察200個(gè)上皮細(xì)胞，觀察染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)后進(jìn)行打分，兩者相加之和即為評(píng)分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比打分的標(biāo)準(zhǔn):0分——陰性;1分——陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10％;2分——11％≤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜50％;3分——51％≤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜80％;4分——陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥80％。根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行打分的標(biāo)準(zhǔn):0分——無(wú);1分——弱陽(yáng)性;2分——中等陽(yáng)性;3分——強(qiáng)陽(yáng)性。
　　 5、Western-

9、blotting實(shí)驗(yàn)
　　 用Western-blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)差異蛋白的表達(dá)。取適量樣本蛋白行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜，順序孵育一抗、二抗。然后用電化學(xué)發(fā)光法顯示條帶。所得條帶用PD QUEST軟件進(jìn)行半定量分析。
　　 4、q RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)
　　 通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)EHD2、PDLIM7的基因在結(jié)直腸癌腫瘤組織及正常粘膜組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1

10、、iTRAQ聯(lián)合LC/MS鑒定組織差異蛋白質(zhì)
　　 共鑒定到802個(gè)蛋白。認(rèn)定差異蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)-1、含量差異P＜0.05，2、在正常組織與腫瘤組織中的含量比值≥1.5或≤0.5。同時(shí)滿(mǎn)足以上2項(xiàng)的即為差異蛋白。共有68個(gè)差異蛋白（33個(gè)上調(diào)，35個(gè)下調(diào)）。經(jīng)Swiss-Prot和GeneOntcology數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，差異蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)，其功能與細(xì)胞粘附、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合等相關(guān)。從中挑選了EH

11、D2及PDLIM7進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 2、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 EHD2表達(dá)于84.48％的正常粘膜組織，在結(jié)直腸癌腫瘤組織中低表達(dá)，僅表達(dá)25.86％。
　　 PDLIM7表達(dá)于81.03％的正常粘膜組織，在結(jié)直腸癌腫瘤組織中低表達(dá)，僅表達(dá)29.31％。
　　 3、Western-blotting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)
　　 證實(shí)了EHD2及PDLIM7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)低于正常粘膜組織。