HCV5’非翻譯區(qū)靶向性M1GS核酶構建及其胞內反義活性的研究.pdf

1、根據(jù)HCV基因組5’非翻譯區(qū)(5’UTR)的序列,借助計算機軟件模擬,設計并構建了一組針對該區(qū)序列中不同靶位的人工M1GS核酶(M1GS-HCV/C20、M1GS-HCV/C67、M1GS-HCV/C76、M1GS-HCV/T86、M1GS-HCV/C89和M1GS-HCV/T160)。通過雙酶切、PCR及測序等方法證實,所構建的這六種M1GS重組質粒均克隆成功。此外,截取包括HCV5’UTR在內的部分基因片段,將其成功插入至pGEM-

2、9z(f)質粒的MCS中,構建了含有底物DNA片段的另一個重組質?！猵GEM-HC。分別將各M1GS重組質粒的轉錄產物與pGEM-HC質粒的轉錄產物在體外混合,結果發(fā)現(xiàn)M1GS-HCV/C20、M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C76三種人工核酶顯示出對底物RNA片段的切割活性,其中M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C76活性相對較高,而M1GS-HCV/T86、M1GS-HCV/C89和M1GS-HCV/T160這

3、三種人工核酶則沒有明顯的切割活性。進一步將體外初篩有效的三種M1GS核酶基因插入逆轉錄載體質粒pLXSN中,構建相應的M1GS真核表達載體。與此同時,將HCV5’UTR的DNA片段插入至pGEF-N1質粒的綠色熒光蛋白基因的上游,成功構建了受控于HCV5’UTR的綠色熒光融合表達載體。再分別將各M1GS真核表達載體與該綠色熒光融合表達載體通過脂質體共轉染Hela細胞(同時以表達紅色熒光蛋白的質粒pDsRed2-C1作為轉染的內對照),建

4、立了一種有效的M1GS核酶胞內復篩系統(tǒng)。通過熒光顯微觀察綠色熒光的變化,并進一步通過Typhoon9200對各組細胞中綠色熒光的表達強度進行掃描。結果發(fā)現(xiàn):核酶M1GS-HCV/C20和M1GS-HCV/C76可大大抑制綠色熒光蛋白的表達,抑制率分別為77.54±1.97％和80.35±1.48%,而核酶M1GS-HCV/C67對綠色熒光的抑制作用則相對較弱,僅為58.82±0.88%。此外,實驗過程中還針對M1GS核酶與底物在體外進行