TLR7在HCV感染過程中的免疫激活及胞內(nèi)區(qū)功能研究.pdf

1、HCV是一種正單鏈RNA 病毒，能夠通過感染宿主細胞，引發(fā)機體病毒性肝炎、肝纖維化乃至肝癌的發(fā)生。HCV的感染往往伴隨機體因天然免疫而引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)，此過程有眾多模式識別受體的參與。Toll樣受體是一類通過識別病原相關(guān)分子模式，介導(dǎo)機體天然免疫，并能作為橋梁連接機體天然免疫與獲得性免疫的一類重要模式識別受體。Tol l 樣受體能夠識別多種病原微生物的固有成分，介導(dǎo)機體針對多種病原菌與病毒的免疫反應(yīng)。TLR7 存在于細胞內(nèi)體表面，通過

2、識別包括I 型HIV、手足口病及A 型流感病毒在內(nèi)的多種單鏈RNA 病毒，介導(dǎo)機體抗病毒免疫。TLR7 被其配體激活后，通過下游接頭蛋白分子MyD88 將激活信號向下游傳遞，最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進而產(chǎn)生多種促炎因子與I 型干擾素，引起機體炎癥反應(yīng)。TLR7 屬于I 型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)由多個富含亮氨酸的LRR 區(qū)組成，主要參與TLR7與其配體的識別，跨膜區(qū)主要負責(zé)TLR7分子的錨定，而胞內(nèi)區(qū)則負責(zé)T

3、LR7激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。目前雖然研究發(fā)現(xiàn)多種單鏈RNA 病毒感染所激活的天然免疫反應(yīng)均有TLR7分子參與，但在HCV 感染機體所引起的天然免疫應(yīng)答過程中，TLR7的所起的作用尚不明確。此外，雖然TLR7分子通過其胞內(nèi)區(qū)將激活信號向下傳遞，但TLR7分子胞內(nèi)區(qū)介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機制還不清楚。根據(jù)以上研究背景，本研究從HCV 感染所激活機體天然免疫反應(yīng)入手，闡明TLR7在HCV 感染過程中的作用，并進一步從蛋白一級結(jié)構(gòu)影響功能的角度，解釋了

4、TLR7 被激活后通過胞內(nèi)區(qū)進行信號傳遞的具體機制。因此本研究主要從HCV 感染過程中TLR7分子的作用與TLR7分子胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)對信號傳遞的影響兩個方面，分為如下兩個部分進行：
　　 1.HCV 感染過程中TLR7分子的作用：
　　 本研究首先利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV基因組的Huh7細胞所表達的HCV 全基因組RNA刺激外周血單核細胞（PBMCs），通過ELISA 檢測細胞因子表達量，我們發(fā)現(xiàn)HCV基因組RNA能夠刺激PBMC

5、s 顯著上調(diào)TNF-α與IFN-α。因此證實HCV 可以通過其單鏈RNA基因組激活機體天然免疫反應(yīng)。由于TLR7天然狀態(tài)下的配體為單鏈RNA病毒，因此該激活很可能通過TLR7 介導(dǎo)。由于在細胞內(nèi)體中病毒基因組將被降解成許多大小不等的寡聚核苷酸片段（ORNs），因此我們根據(jù)TLR7 識別序列特點，以HCV基因組為模板人工合成多條ORNs，并用這些ORNs 刺激新分離的PBMCs細胞，通過ELISA 檢測我們證實位于1000位的ORN100

6、0與位于HCV 3’端尾部的ORNHCVtail能夠刺激PBMCs上調(diào)TNF-α與IFN-α的表達。TLR7 被配體激活后將活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B與IRF7，從而啟動基因的表達。因此，我們利用人工合成的ORNs 刺激Huh7細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測我們發(fā)現(xiàn)ORN1000與ORNHCVtail 可以激活NF-κ B與IRF7。為了確定TLR7是否真的參與HCV 感染過程所引起的免疫激活，我們通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)TLR7 被干

7、擾時，ORNs 刺激細胞所造成NF-κ B的激活強度明顯下降。而通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使TLR7 過表達后，NF-κ B的激活強度顯著提高。因此，我們確定HCV基因組片段對于機體天然免疫反應(yīng)的激活能夠通過TLR7 進行的。
　　 2.TLR7分子結(jié)構(gòu)對信號傳遞的影響：
　　 TLR7分子被激活后能夠通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活基因表達。雖然TLR7通過胞內(nèi)區(qū)募集接頭蛋白MyD88 從而激活信號通路已比較清楚，然而該分子具體通過胞內(nèi)

8、區(qū)哪些位點介導(dǎo)對MyD88的募集卻尚無定論。因此我們對TLR7 胞內(nèi)區(qū)蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行分析，以期篩選出對TLR7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用位點，并解釋其產(chǎn)生作用的機制。首先，我們分析了TLR7 胞內(nèi)區(qū)的序列特征，并且構(gòu)建了胞內(nèi)區(qū)全長與半長缺失體的真核表達質(zhì)粒，通過對雙熒光素酶報告基因檢測NF-κ B的激活情況，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TLR7 胞內(nèi)區(qū)全長與半長缺失體的實驗組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對照組之間均無差別，因此我們將TLR7 胞內(nèi)區(qū)的關(guān)鍵位點鎖定在胞

9、內(nèi)區(qū)的后半段。接著，我們在胞內(nèi)區(qū)后半段以大約20個氨基酸為間隔構(gòu)建了一系列的缺失質(zhì)粒。通過檢測NF-κ B 激活情況，我們將關(guān)鍵位點鎖定在一個含有16個氨基酸的區(qū)域。然后，我們通過一系列位點特異性點突變的方法，證明這16個氨基酸中存在2個分別位于1004位與1006 位的精氨酸能夠?qū)LR7 功能產(chǎn)生影響。最后我們通過免疫共沉淀的方法證明，這2個精氨酸中只有1004 位的精氨酸是通過影響TLR7與下游接頭蛋白MyD88的結(jié)合來影響TLR