靶向性重組Tum-5基因?qū)δ[瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腫瘤的生長(zhǎng)依賴于血管的新生，抑制腫瘤血管的生成已經(jīng)成為一種腫瘤治療的策略。Tumstatin（Ⅳ型膠原α3鏈的非膠原區(qū)域1）是一種內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子，它與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的αvβ3整合素結(jié)合進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使腫瘤血管的生成受到抑制，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Tum-5是由Tumstatin接近N端的54-132位氨基酸組成，為全長(zhǎng)Tumstatin抗血管形成的功能結(jié)構(gòu)域，以非RGD依賴的形式與整合素α

2、vβ3結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)血管新生，與全長(zhǎng)Tumstatin具有同等的抑制新生血管形成作用。
　　NGR多肽（CNGRCVSGCAGRC）是利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選得到的能夠與活化的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽序列。其受體是高表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD13/APN分子。CD13/APN是新生血管形成過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子，主要參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。利用NGR的這一特性，已成功得將化療藥物、TNF、誘導(dǎo)凋亡的短肽等抗腫瘤

3、藥物靶向性地運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織的新生血管處，既提高了藥物的療效又明顯降低了毒副作用。
　　本實(shí)驗(yàn)中將NGR多肽編碼序列與Tum-5基因重組，表達(dá)了腫瘤新生血管靶向的血管生成抑制因子（Tum-5-NGR）。我們希望該融合蛋白通過NGR多肽與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD13/APN結(jié)合，既能使Tum-5在腫瘤組織的新生血管處富集，針對(duì)性地發(fā)揮它的抑制腫瘤血管形成和抗腫瘤作用；又可以起到抑制CD13/APN介導(dǎo)的新生血管形成作用，從而降低臨

4、床用藥量，提高量效比，同時(shí)降低毒副作用。
　　由于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)表達(dá)的Tum-5蛋白進(jìn)行免疫印跡和其它檢測(cè)都需要用到相應(yīng)抗體，而目前還沒有針對(duì)Tum-5的商業(yè)化抗體及ELISA檢測(cè)試劑盒，因此首先以原核細(xì)胞表達(dá)的Tum-5蛋白免疫動(dòng)物制備了兔抗Tum-5多克隆抗體。
　　將Tum-5及Tum-5-NGR基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（pcDNA-tum-5/pcDNA-tum-5-NGR），分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過G

5、418抗生素篩選得到能持續(xù)分泌表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株。分泌重組蛋白對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞自身生長(zhǎng)沒有影響。體外試驗(yàn)中，含有重組蛋白的分泌型細(xì)胞培養(yǎng)上清可對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、小管形成和運(yùn)動(dòng)遷移能力形成明顯抑制。
　　重組質(zhì)粒于小鼠脛前肌注射后提取肌肉組織RNA進(jìn)行RT-PCR分析，檢測(cè)到外源基因mRNA水平上的表達(dá)。抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照組相比，重組質(zhì)粒pcDNA-tum-5或pcDNA-tum-5-NGR均能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織生長(zhǎng)的顯著抑

6、制，抑瘤率分別達(dá)到29.4％與54.1％。其中pcDNA-tum-5-NGR靶向治療組抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用明顯優(yōu)于pcDNA-tum-5治療組。腫瘤組織HE與CD31染色表明pcDNA-tum-5-NGR靶向治療組較pcDNA-tum-5治療組腫瘤組織內(nèi)新生血管密度顯著減少。
　　Pichiapastoris酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)能力的真核表達(dá)系統(tǒng)。以酵母分泌表達(dá)重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，且上清中雜

7、蛋白含量低，可以簡(jiǎn)化純化工藝。因此，我們將Tum-5及Tum-5-NGR基因分別克隆入分泌型酵母表達(dá)載體pPICZaA（pPICZaA-tum-5/pPICZaA-tum-5-NGR），重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母后以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE及Westernblot免疫印跡檢測(cè)到目的蛋白條帶。
　　綜上所述，本文首先研究構(gòu)建pcDNA-tum-5與pcDNA-tum-5-NGR重組真核表達(dá)質(zhì)粒，證實(shí)了重組質(zhì)粒能夠在體外和體內(nèi)高效分泌表