Flt-1胞外Ⅰ-Ⅲ區(qū)單克隆抗體的制備及其活性鑒定.pdf

1、血管新生(angiogenesis)是一個(gè)受高度調(diào)控的多步驟過程,包括內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖、遷移和重塑,與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移高度相關(guān).血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管新生的重要調(diào)節(jié)因子,在實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的血管新生中有不容置疑的作用.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Ⅰ(fms-like tyrosine kinase,Flt-1)是VEGF受體之一,不僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,腎

2、小球系膜細(xì)胞,胎盤滋養(yǎng)層,單核巨噬細(xì)胞,而且在許多實(shí)體瘤及血液腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá).Flt-1是VEGF的高親和力受體之一,屬酪氨酸蛋白激酶第Ⅲ亞型,其結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū),跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),在其胞外區(qū)的7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域中,氨基端的Ⅰ-Ⅲ區(qū)是Flt-1的配體結(jié)合域所在區(qū).本文的主要目的是制備抗Flt-1胞外Ⅰ-Ⅲ區(qū)的單克隆抗體,探討其生物活性,為以后制備基因工程抗體作好準(zhǔn)備工作.通過從人胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA,利用RT-PCR和P

3、CR方法克隆Flt-1胞外Ⅰ-Ⅲ區(qū)的基因,通過與表達(dá)載體pET-28a(+)進(jìn)行相同的酶切消化,構(gòu)建成Flt-1胞外Ⅰ-Ⅲ區(qū)的表達(dá)載體pET-28a(+)-F,并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,SDS-PAGE和Western blot分析顯示,其分子量約為37kD,用超聲裂解、鹽酸胍變性等方法處理包涵體,經(jīng)鎳柱純化后用精氨酸溶液復(fù)性,復(fù)性產(chǎn)物免疫Balb/c小鼠,采用傳統(tǒng)B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備抗Flt-1胞