尿激酶介導(dǎo)的腫瘤靶向性rhTNF-α原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、[目的]
　　 1.應(yīng)用基因工程技術(shù),初步實施hTNF-α靶向改造方案,將本課題組已經(jīng)構(gòu)建好的pET-32a(+)-collagen-MMP-hTNF系列質(zhì)粒中的膠原蛋白(collagen)序列和明膠酶(MMP-2和MMP-9)底物序列分別用foldon序列和尿激酶(uPA)底物序列替換,構(gòu)建出帶有foldon序列,uPA底物序列和hTNF-α突變體基因的4種的pET42a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒(即pET42a(+)-foldon-

2、uPA1-hTNF-α,pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α,pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α,pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α,并實現(xiàn)在大腸桿菌Rosetta2(DE3)中的高效表達(dá);
　　 2.初步確立rhTNF-α融合基因表達(dá)產(chǎn)物的純化的最佳方案,獲得四種rhTNF-α融合蛋白的初步純化產(chǎn)物。
　　 3.驗證尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)對融合蛋

3、白的去封閉效果。
　　 4.去封閉融合蛋白生物學(xué)活性的初步研究
　　 [方法]
　　 1.重組pET42a(+)-foldon質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 將foldon序列克隆至原核表達(dá)載體pET42a(+)中,篩選陽性重組子并進(jìn)行DNA序列分析,篩選出序列正確的質(zhì)粒并命名為重組pET42a(+)-foldon。
　　 2.重組pET42a(+)-foldon-uPA-hTNF質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 1)

4、用PCR方法擴(kuò)增得到帶有uPA底物序列和hTNF-α突變體基因的融合基因序列。
　　 2)將擴(kuò)增的融合基因序列產(chǎn)物克隆連接至pET42a(+)-foldon質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化,篩選陽性克隆。
　　 3)對陽性重組子進(jìn)行DNA序列分析,獲得序列正確的帶uPA底物序列和hTNF-α突變體基因的重組質(zhì)粒,分別命名為重組pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α、

5、pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α和pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α質(zhì)粒。
　　 3.重組pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α和pET42a(+)-foldon-uPA4-hTNF-α表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta2(DE3)中的表達(dá)
　　

6、 1)將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta2(DE3),篩選陽性重組子并進(jìn)行DNA序列分析。
　　 2)IPTG誘導(dǎo)陽性重組細(xì)菌表達(dá)目的蛋白。
　　 4.表達(dá)產(chǎn)物的提取、純化
　　 1)按Novagen公司Bug8uster GST·Bind Purification Kits方法進(jìn)行融合蛋白的提取和純化。
　　 2)SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物。
　　 5.uPA對融合蛋白的去封

7、閉效果研究
　　 用uPA分別酶切四種融合蛋白,SDS-PAGE鑒定酶切條帶。
　　 6.去封閉融合蛋白生物學(xué)活性的初步研究
　　 以生理鹽水為陰性對照和hTNF-α標(biāo)準(zhǔn)品為陽性參照,選取對切除GST標(biāo)簽的融合蛋白1(即foldon-uPA1-hTNF-α)、經(jīng)uPA酶切后的去封閉融合蛋白1(即rhTNF-α),利用MTT法檢測去封閉融合蛋白1的細(xì)胞毒性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.應(yīng)用基因克隆技

8、術(shù),成功構(gòu)建foldon序列的表達(dá)質(zhì)粒(pET42a(+)-foldon質(zhì)粒),DNA測序結(jié)果顯示,重組表達(dá)載體序列與理論序列完全吻合。
　　 2.成功構(gòu)建帶有foldon序列和尿激酶(uPA)底物序列和hTNF-α突變體基因的4種表達(dá)質(zhì)粒(重組pET42a(+)-foldon-uPA1-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF-α、pET42a(+)-foldon-uPA3-hTNF-α和pET42a

9、(+)-foldon-uPA4-hTNF-α質(zhì)粒),DNA測序結(jié)果顯示,重組表達(dá)載體序列與理論序列完全吻合。
　　 3.初步確立了4種重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta2(DE3)中的表達(dá)條件,并實現(xiàn)了四種rhTNF-α融合蛋白的高效、可溶性表達(dá),獲得4種rhTNF-α融合基因的表達(dá)產(chǎn)物。
　　 4.確定了融合蛋白的純化方案,成功切除了融合蛋白上的GST標(biāo)簽。
　　 5.初步驗證了uPA對融合蛋白的去封閉效果。

10、
　　 6.融合蛋白和去封閉融合蛋白能誘導(dǎo)高表達(dá)uPA的腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 [結(jié)論]
　　 利用基因工程技術(shù)對hTNF-α的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成功改造,初步探索了rhTNF-α在大腸桿菌Rosetta2(DE3)高效、可溶性表達(dá)的最佳條件以及表達(dá)產(chǎn)物的提取純化方法。獲得切除了GST載體標(biāo)簽的四種融合蛋白的三聚體化(活性形式)的純化產(chǎn)物,驗證了尿激酶(uPA)對融合蛋白的去封閉效果,融合蛋白和去封閉融合蛋白能誘導(dǎo)高表達(dá)u