異體牙周膜干細(xì)胞移植與機(jī)體體液(B細(xì)胞)免疫應(yīng)答研究.pdf

1、牙齒缺失修復(fù)及牙周組織再生是口腔科學(xué)的工作和研究中心之一，目前臨床上對(duì)牙周炎致骨缺損的治療仍然是一個(gè)難題，而利用義齒包括固定義齒、活動(dòng)義齒和種植義齒等修復(fù)是一類(lèi)贗復(fù)體修復(fù)，缺乏真正意義上的生物修復(fù)。近年來(lái)，關(guān)于牙齒干細(xì)胞及組織工程技術(shù)的研究進(jìn)展給牙齒和牙周組織生物再生帶來(lái)了新的希望。諸多研究提示牙齒相關(guān)干細(xì)胞是牙齒再生和牙周組織再生的最佳種子細(xì)胞來(lái)源，具有較廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，自體牙齒干細(xì)胞來(lái)源有限，如果牙齒干細(xì)胞能異體應(yīng)用，就能

2、明顯擴(kuò)大牙齒再生種子細(xì)胞來(lái)源，極大推進(jìn)牙齒和牙周組織再生的發(fā)展。機(jī)體的免疫分為細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)牙齒相關(guān)干細(xì)胞不會(huì)引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是牙齒相關(guān)干細(xì)胞對(duì)機(jī)體體液免疫應(yīng)答（B淋巴細(xì)胞）的影響尚不清楚。為了同種異體牙周膜干細(xì)胞能夠?qū)?lái)安全地用于臨床，本研究擬探討牙周膜干細(xì)胞對(duì)同種異體B淋巴細(xì)胞功能的影響，并利用小型豬模型，觀(guān)察牙周膜干細(xì)胞異體移植修復(fù)牙周炎骨缺損的能力及有無(wú)體液免疫排斥。本研究包括以下三個(gè)部分:

3、
　　第一部人牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　目的:分離培養(yǎng)及鑒定人牙周膜干細(xì)胞，為下一步對(duì)牙周膜干細(xì)胞的其他性能進(jìn)行研究提供必要的基礎(chǔ)和前提。方法:選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔頜面外科門(mén)診拔除阻生第三磨牙的患者，無(wú)菌條件下剝離牙根外牙周組織，參照以往關(guān)于人牙齒相關(guān)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及條件，分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞，并通過(guò)倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀等對(duì)其生長(zhǎng)特性、誘導(dǎo)分化能力，表面標(biāo)志物進(jìn)行觀(guān)察。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的人

4、牙周膜干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈梭性。牙周膜干細(xì)胞的克隆形成率為（15-28個(gè)/105）。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞中的STRO-1，CD146，CD90，SSEA-4，OCT-4，其表達(dá)陽(yáng)性率分別為13.34±1.83％，80.61％±5.41％，98.67％±1.03％，88.67％±4.03％，95.33％±4.53％。經(jīng)誘導(dǎo)分化后，牙周膜干細(xì)胞在體外有誘導(dǎo)分化成骨和成脂肪的能力。
　　結(jié)論:人牙周膜干細(xì)胞可在體外成

5、功培養(yǎng)，表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，并有橫向分化的潛能。
　　第二部分人牙周膜干細(xì)胞對(duì)同種異體B淋巴細(xì)胞的影響
　　目的:在體外研究人牙周膜干細(xì)胞對(duì)同種異體B淋巴細(xì)胞功能的影響。
　　方法:正常人外周血的B淋巴細(xì)胞與人牙周膜干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖、凋亡、分化、趨化、分泌功能和共刺激分子表達(dá)的檢測(cè)，從而研究牙周膜干細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞功能的影響，同時(shí)用hBMSCs作同型對(duì)照，并通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)，CBA、抗體中

6、和實(shí)驗(yàn)等來(lái)研究牙周膜干細(xì)胞影響B(tài)淋巴細(xì)胞增殖和凋亡的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，牙周膜干細(xì)胞抑制由CpG ODN、rCD40L、Anti-immunoglobulin(IgA+IgG+IgM)、IL-2和IL-4引起的B淋巴細(xì)胞增殖，且這種抑制具有濃度依賴(lài)性;延遲加入牙周膜干細(xì)胞也能抑制由上述刺激所引起的B淋巴細(xì)胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子(CD40、CD80、CD86和HLA DR)

7、的表達(dá)和分泌功能不產(chǎn)生影響，但對(duì)B淋巴細(xì)胞的分化和趨化功能有抑制作用。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):牙周膜干細(xì)胞抑制B淋巴細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是通過(guò)細(xì)胞接觸和可溶性分子共同作用。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):共培養(yǎng)后，牙周膜干細(xì)胞表面PD-1、PD-L1和PD-L2表達(dá)發(fā)生改變;進(jìn)一步利用抗體中和實(shí)驗(yàn)證明，牙周膜干細(xì)胞可能是通過(guò)PD-1和PD-L1來(lái)部分抑制B淋巴細(xì)胞增殖。凋亡實(shí)驗(yàn)表明，牙周膜干細(xì)胞并非通過(guò)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用

8、，相反，牙周膜干細(xì)胞通過(guò)分泌IL-6抑制B淋巴細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論: hPDLSCs和hBMSCs類(lèi)似，能夠抑制B淋巴細(xì)胞的增殖，而且這種抑制作用呈濃度依賴(lài)性;hPDLSCs對(duì)B細(xì)胞的分化、趨化功能也有抑制作用，但對(duì)B細(xì)胞的抗原提呈功能和分泌功能無(wú)明顯影響:hPDLSCs通過(guò)分泌IL-6抑制B淋巴細(xì)胞的凋亡;hPDLSCs通過(guò)PD-1及PD-L1部分抑制B淋巴細(xì)胞的增殖，與B淋巴細(xì)胞的凋亡無(wú)關(guān)。
　　第三部分小型豬牙周膜干

9、細(xì)胞同種異體移植后對(duì)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的影響
　　目的:在體內(nèi)研究牙周膜干細(xì)胞的異體移植后對(duì)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的影響。
　　方法:選用雌性五指山小型豬12只，建立牙周炎骨缺損模型，同時(shí)分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增五指山小型豬和雄性貴州小型香豬牙周膜干細(xì)胞。建模后1個(gè)月開(kāi)始治療，分為4組:(1)空白對(duì)照組:建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型后不做任何處理;(2) HA/TCP組:在建模后做翻瓣刮治+ HA/TCP修復(fù)，覆蓋以明膠海綿;(3)自體牙周膜干細(xì)胞

10、+HA/TCP組:建模后做翻瓣刮治+自體牙周膜干細(xì)胞+ HA/TCP修復(fù)，覆蓋以明膠海綿;(4)異體牙周膜干細(xì)胞+ HA/TCP組:建模后做翻瓣刮治+雄性貴州小型香豬牙周膜干細(xì)胞+ HA/TCP修復(fù)，覆蓋以明膠海綿。觀(guān)察指標(biāo)包括臨床觀(guān)察（牙周探診深度、附著喪失等）、影像學(xué)檢查、血液學(xué)檢查、組織學(xué)觀(guān)察和體液免疫指標(biāo)等的檢測(cè)。
　　結(jié)果:成功建立牙周炎模型，各組模型之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;治療后12周，發(fā)現(xiàn)自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)

11、胞組的牙周指數(shù)（牙齦退縮、牙槽骨缺失和牙周袋深度）與空白對(duì)照組、HA/TCP組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但治療后自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)胞組牙周指數(shù)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CT掃描發(fā)現(xiàn)，治療后12周，自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)胞組都有明顯的新生骨質(zhì)影像，而空白對(duì)照組和HA/TCP組卻不明顯。血液學(xué)研究表明，無(wú)論是治療前還是治療后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各治療組的血常規(guī)、血生化、免疫球蛋白和體液免疫學(xué)指標(biāo)(CD20，CD25，B220)都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)差異，同時(shí)檢測(cè)齦溝液和牙周組織的免疫球蛋白也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明異體干細(xì)胞移植組在治療后無(wú)炎性病變產(chǎn)生，無(wú)肝腎功能的損傷，無(wú)近期或者遠(yuǎn)期體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生。組織學(xué)觀(guān)察表明，在自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)胞組，都有明顯的牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜再生，骨缺損基本修復(fù)，而在空白對(duì)照組和HA/TCP組，仍可見(jiàn)明顯的典型牙周炎表現(xiàn)，包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成。最后通過(guò)細(xì)胞移植術(shù)后1周和2周，對(duì)自體移植組和異體移植組的局部牙周組織IL