慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓的病理生理機(jī)制研究及心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)的預(yù)測(cè)作用.pdf

1、慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓(Chronicthromboembolic pulmonaryhypertension，CTEPH)在肺動(dòng)脈高壓分類中屬于第四大類。急性肺血栓栓塞癥(Acute pulmonary thromboembolism，APE)患者5年內(nèi)發(fā)生CTEPH的累積發(fā)病率約為0.4％-5.1％。這一部分患者發(fā)生CTEPH的病理生理機(jī)制目前不明確。CTEPH的病理特征為肺動(dòng)脈內(nèi)不能消融的血栓繼發(fā)纖維化、機(jī)化。既往有多項(xiàng)研究顯示

2、:1、鐵代謝紊亂與血栓性疾病密切相關(guān)。2、病理研究顯示CTEPH患者的非阻塞血管的遠(yuǎn)端動(dòng)脈也發(fā)生了與特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)相同的叢狀病變?；蛲蛔兪翘匕l(fā)性PAH及可遺傳性PAH的重要發(fā)病機(jī)制，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因突變與PAH發(fā)病有關(guān)，CTEPH患者是否存在PAH相關(guān)的基因突變目前尚不清楚。3、差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究是明確疾病發(fā)病機(jī)制、尋找疾病特異的蛋白質(zhì)分子的良好方法。4、及

3、早發(fā)現(xiàn)CTEPH的存在并給予積極治療有望改善患者預(yù)后。因此本課題從鐵代謝、基因突變和蛋白質(zhì)組學(xué)三個(gè)方面探討CTEPH可能的發(fā)病機(jī)制;并以心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)評(píng)估APE后不同疾病狀態(tài)患者的表現(xiàn)，以尋找預(yù)測(cè)CTEPH的敏感因子。
　　二、研究?jī)?nèi)容
　　第一部分鐵代謝在CTEPH發(fā)病過(guò)程中作用的研究
　　1、研究目的:
　　通過(guò)比較CTEPH患者和急性PE事件后痊愈的患者鐵代謝情況，明確鐵代謝是否與CTEPH有關(guān)。
　　

4、2、研究方法
　　2.1研究對(duì)象:2013年4月至2014年3月在阜外醫(yī)院肺血管病科住院的明確診斷的CTEPH患者和慢性PE患者。
　　2.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè):收集空腹血漿，檢測(cè)血漿自由鐵濃度、鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)、hepcidin-25、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、丙二醛(MDA)水平。
　　2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:連續(xù)數(shù)據(jù)兩組間比較采用student' s t檢驗(yàn)或Mann-Whi

5、tney U檢驗(yàn);分類變量的兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)。非結(jié)合鐵離子濃度與hepcidin-25、sTfR，鐵蛋白、sTfR/鐵蛋白比值、TNF-α、IL-6、MDA間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。 hepcidin-25濃度與上述各檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)系采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。Logistic回歸模型分析CTEPH與上述各檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)系。
　　3、研究結(jié)果
　　血漿非結(jié)合鐵離子濃度在CTEPH組與慢性PE對(duì)照組

6、無(wú)明顯差別。兩組間hepcidin-25、sTfR、TNF-α、MDA水平也無(wú)顯著差別。CTEPH組的IL-6顯著高于對(duì)照組。hepcidin-25水平與sTfR濃度呈負(fù)相關(guān)(Spearman's r=-0.438，p＜0.001); hepcidin-25水平與鐵蛋白呈正相關(guān)(Spearman's r=0.503，p＜0.001)。血漿非結(jié)合鐵離子濃度與hepcidin-25、sTfR、鐵蛋白、sTfR/鐵蛋白比值、TNF-α、IL-

7、6、MDA均無(wú)顯著相關(guān)(見(jiàn)表i-3).單變量logistic回歸分析顯示，非結(jié)合鐵離子濃度、sTfR、鐵蛋白、sTfR/鐵蛋白比值、TNF-α、IL-6、MDA均與CTEPH發(fā)病無(wú)明顯關(guān)系。
　　4、第一部分研究結(jié)論
　　鐵代謝水平與CTEPH發(fā)病無(wú)明確相關(guān)。CTEPH患者和慢性PE患者的機(jī)體sTfR水平及鐵蛋白水平均在正常范圍。
　　第二部分 CTEPH患者的基因突變研究
　　1、研究目的
　　通過(guò)比較C

8、TEPH患者和有PE病史而無(wú)PAH的患者的基因變異情況，目的是明確PAH相關(guān)的基因突變是否參與了CTEPH的發(fā)病。
　　2、研究方法
　　2.1研究對(duì)象:49名CTEPH患者和17名有PE病史而無(wú)PH的對(duì)照組患者。
　　2.2基因突變檢測(cè):收集血液標(biāo)本，提取全基因組DNA。直接測(cè)序并與參考序列比對(duì)檢測(cè)PAH相關(guān)的基因:BMPR2、ACVRL1、ENG、SMAD9、CAV1、KCNK3、CBLN2。多重連接探針擴(kuò)增(ML

9、PA)方法檢測(cè)片段重排突變。點(diǎn)突變對(duì)基因功能的影響以PolyPhen-2軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　2.3兩組間的基因突變頻率比較采用Fisher's檢驗(yàn)。采用卡方檢驗(yàn)明確基因型分布是否服從Hardy-Weinberg平衡定律。
　　3、研究結(jié)果
　　共66個(gè)樣本進(jìn)行了基因變異的分析，包括49名CTEPH患者及17名PE后無(wú)PAH的患者。CBLN2的CDS1因技術(shù)原因PCR擴(kuò)增失敗。共發(fā)現(xiàn)40個(gè)基因突變位點(diǎn)，包括31個(gè)點(diǎn)突變和

10、9個(gè)片段重排。13個(gè)位點(diǎn)很可能造成功能破壞，2個(gè)突變位點(diǎn)可能造成破壞，2個(gè)突變位點(diǎn)為良性突變。3名研究對(duì)象有多處的點(diǎn)突變。CTEPH患者的PAH相關(guān)基因的非同義突變比率大于對(duì)照組(CTEPH組25/49(51％) vs.對(duì)照組3/17(18％)，p=0.022)。共發(fā)現(xiàn)12個(gè)在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中已有記錄的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。比較了兩組間的基因型及等位基因頻率后，發(fā)現(xiàn)SN

11、P rs3739817和SNP rs55805125與CTEPH有關(guān)。
　　4、第二部分研究結(jié)論
　　中國(guó)漢族CTEPH患者中較高的PAH致病基因的突變頻率可能與CTEPH發(fā)病有關(guān)。
　　第三部分 CTEPH患者的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　1、研究目的
　　從CTEPH患者的肺動(dòng)脈內(nèi)膜切除組織中進(jìn)行差異蛋白質(zhì)對(duì)比，以尋求發(fā)病過(guò)程中的“特異蛋白質(zhì)分子”或“特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”。
　　2、研究方法
　　2

12、.1實(shí)驗(yàn)分組:1）CTEPH患者行肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜切除術(shù)中取得的增生內(nèi)膜組織提取蛋白質(zhì)的等份混合物;2）培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、人肺成纖維細(xì)胞，收集并鑒定后提取蛋白質(zhì)的等份混合物。
　　2.2兩組蛋白質(zhì)混合物以高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)分離后作色質(zhì)聯(lián)用進(jìn)一步分離、鑒定。
　　2.3兩次均分離鑒定到的蛋白質(zhì)在兩組間比較，取得病變組織特

13、異表達(dá)的蛋白質(zhì)譜作進(jìn)一步的GO和KEGG生物信息學(xué)分析。
　　3、研究結(jié)果
　　組織特異性的蛋白質(zhì)為679個(gè)。由特異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)過(guò)程富集結(jié)果顯示，特異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與了損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體激活及血液凝固等生物過(guò)程。特異表達(dá)蛋白質(zhì)主要構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)、血小板、分泌顆粒、脂蛋白復(fù)合體以及囊泡等細(xì)胞組分。特異表達(dá)蛋白質(zhì)主要發(fā)揮了與糖類結(jié)合、酶抑制劑激活以及與鈣離子結(jié)合等功能。富集于補(bǔ)體及凝血通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡

14、通路、ECM與受體結(jié)合通路、細(xì)胞粘附分子通路、Fc epsilon RI信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路、朊病毒疾病通路（CCL5，補(bǔ)體C1qa，C1QB，C1QC，C6，C7，C8A，C8B，C8G）、病毒性心肌炎、Fc gamma R介導(dǎo)的胞吞通路等信號(hào)通路。
　　4、第三部分研究結(jié)論
　　此部分CTEPH患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到679個(gè)病變組織特異的蛋白質(zhì)。特異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與了損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反

15、應(yīng)、補(bǔ)體激活及血液凝固等生物過(guò)程。富集于補(bǔ)體及凝血通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?、ECM與受體結(jié)合通路、細(xì)胞粘附分子通路、Fc epsilon RI信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路等信號(hào)通路。
　　第四部分心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)在預(yù)測(cè)CTEPH中的作用
　　1、研究目的
　　在這部分研究中，我們?cè)u(píng)估了APE存活者三種不同的預(yù)后狀態(tài)，以期發(fā)現(xiàn)敏感的心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)的疾病監(jiān)測(cè)指標(biāo)。
　　2、研究方法
　　2.1研究對(duì)象:自2011年

16、1月至2014年5月間連續(xù)入選符合標(biāo)準(zhǔn)的，在我科住院的66名CTEPH患者、44名慢性PE患者、15名PE痊愈患者。慢性PE、PE痊愈患者以及3例CTEPH來(lái)自2011年1月起始的中國(guó)肺栓塞注冊(cè)登記研究(2011BA11B17)。36名健康成年人作為對(duì)照組。
　　2.2心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn):在醫(yī)生監(jiān)督下進(jìn)行癥狀限制的功率遞增式直立踏車運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)。先進(jìn)行3分鐘靜息數(shù)據(jù)采集后開(kāi)始3分鐘的無(wú)負(fù)荷踏車運(yùn)動(dòng)，繼之3分鐘的持續(xù)功率遞增直至最大耐受量。氣

17、體交換采用逐次呼吸測(cè)量系統(tǒng);功率遞增幅度的選擇根據(jù)對(duì)患者病史包括日常運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、體格檢查和肺功能狀況綜合決定。遞增
　　方案:CTEPH組、CPE組為10～15 W/min，對(duì)照組為10～30 W/min。
　　2.3統(tǒng)計(jì)分析:連續(xù)數(shù)據(jù)組間比較采用方差分析;分類變量的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。Pearson或Spearman相關(guān)分析臨床數(shù)據(jù)與VE/VC02斜率、VD/VTphy、最低點(diǎn)VE/VC02比值。多變量線性回歸分析

18、明確CPET中的獨(dú)立預(yù)測(cè)CTEPH的指標(biāo)。受試者工作曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)分析預(yù)測(cè)效力。以ROC曲線的最佳截點(diǎn)分類待測(cè)數(shù)據(jù)，應(yīng)用單變量和多變量logistic回歸分析建立預(yù)測(cè)模型。
　　3、研究結(jié)果
　　CTEPH患者的最低點(diǎn)VE/VC02比值比慢性PE組和PE痊愈組明顯增高(43.4 L/minvs29.9 L/min vs27.1L/min, p＜0.

19、005); VE/VC02斜率(48.4 L/min/L/min vs29.9L/min/L/min vs28.0 L/min/L/min，p＜0.005)及攝氧效率平臺(tái)(OUEP)(37.1 L/minvs27.0 L/min vs25.2 L/min，p＜0.005)也顯著高于慢性PE組和PE痊愈組。Logistic回歸分析顯示，最低點(diǎn)VE/VC02比值≥34.35 L/min是預(yù)測(cè)CTEPH的最強(qiáng)因子(OR159.0，95％ CI

20、36.0-702.3，p＜0.001)。慢性PE組的最低點(diǎn)VE/VC02比值較對(duì)照組高(29.9 L/min vs26.5 L/min，p＜0.05)，但最低點(diǎn)VE/VC02比值在痊愈組和對(duì)照組無(wú)差別。在多元線性回歸分析中，基于肺通氣/灌注顯像評(píng)價(jià)的血管阻塞率(PVO)是慢性PE組和痊愈組的通氣效率指標(biāo)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
　　4、第四部分研究結(jié)論
　　4.1CTEPH患者的通氣效率降低;
　　4.2最低點(diǎn)VE/VC02比

21、值是預(yù)測(cè)CTEPH的最佳指標(biāo);
　　4.3通氣效率隨急性PE恢復(fù)而改善。
　　三、結(jié)論
　　1、鐵代謝水平與CTEPH發(fā)病無(wú)明確相關(guān)。CTEPH患者和慢性肺栓塞患者的機(jī)體sTfR水平及鐵蛋白水平均在正常范圍。
　　2、中國(guó)漢族CTEPH患者中較高的PAH致病基因的突變頻率可能與CTEPH發(fā)病有關(guān)。
　　3、CTEPH患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜切除的組織特異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與了損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體激活及