LSD1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的生物學(xué)作用及其化學(xué)抑制抗癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC，簡(jiǎn)稱口腔鱗癌）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，局部復(fù)發(fā)和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因。然而，口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵的細(xì)胞及分子生物學(xué)事件，特別是致病癌基因或抑癌基因的功能及機(jī)制仍不十分明確，且缺乏抗口腔鱗癌生物/化學(xué)治療的精確靶點(diǎn)以提高患者的生存率和生存質(zhì)量。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(Lysine-specific histone demet

2、hylase1，LSD1)是近年來首先被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，主要通過去除H3K4m2/1和H3K9m2/1的甲基參與基因的調(diào)控過程。目前已有研究證實(shí)LSD1在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，且其異常表達(dá)常與腫瘤的惡性臨床病理學(xué)特征和患者的治療預(yù)后相關(guān)。更重要的是，LSD1已成為抑制腫瘤的生物治療靶點(diǎn)。研究表明應(yīng)用小分子化合物和小干擾RNA能抑制癌細(xì)胞中的LSD1表達(dá)，從而產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)、促使癌細(xì)胞凋亡等抗癌作用。然而，迄今為止，LSD1在

3、口腔鱗癌組織中的表達(dá)情況及其生物學(xué)功能尚未見研究報(bào)道。
　　目的：本研究主要致力于探討組蛋白去甲基化酶LSD1在口腔鱗癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能，揭示靶向LSD1的小分子化學(xué)抑制劑對(duì)口腔鱗癌的體內(nèi)外抑制作用。
　　方法：⑴通過定量RT-PCR、Western blotting和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)口腔鱗癌細(xì)胞系中LSD1的表達(dá)水平與胞內(nèi)定位。⑵通過Western blotting和免疫組織化學(xué)檢測(cè)口腔鱗癌組織標(biāo)本中LSD1的表達(dá)，

4、并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析LSD1的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)、總體生存率的關(guān)系。⑶通過構(gòu)建DMBA誘導(dǎo)的金黃地鼠頰癌模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)在口腔頰黏膜癌變主要階段，標(biāo)本中LSD1的表達(dá)水平。⑷應(yīng)用siRNA介導(dǎo)的基因沉默策略抑制口腔鱗癌細(xì)胞中的LSD1，通過MTT、流式凋亡、遷移、侵襲以及體內(nèi)成瘤等實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)情況，觀察口腔鱗癌細(xì)胞中LSD1沉默對(duì)細(xì)胞惡性表型、腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。⑸選擇LSD1特異性小分子抑制劑巴吉林(parg

5、yline，PG)和反苯環(huán)丙胺(tranylcypromine，TCP)體外作用于口腔鱗癌細(xì)胞，通過Western blotting驗(yàn)證PG和TCP對(duì)細(xì)胞中LSD1的抑制作用;再通過MTT、流式凋亡和遷移等實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)改變，觀察口腔鱗癌細(xì)胞中LSD1沉默對(duì)細(xì)胞惡性表型的影響。⑹構(gòu)建裸鼠口腔鱗癌荷瘤模型，待成瘤后分別予以PG或TCP腹腔注射，觀察對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響;治療干預(yù)后獲取移植瘤標(biāo)本，檢測(cè)標(biāo)本體積與重量，并通過HE和免疫

6、組化染色觀察不同組織標(biāo)本中LSD1、Ki67等基因表達(dá)的差異。
　　結(jié)果：①定量RT-PCR、Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌細(xì)胞中LSD1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于人永生化細(xì)胞HIOEC;細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LSD1主要位于胞核中，少量位于胞漿中。②臨床新鮮口腔鱗癌標(biāo)本W(wǎng)estern blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中LSD1蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常黏膜;免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)LSD1在64例口腔鱗癌

7、標(biāo)本中有42例呈強(qiáng)陽性表達(dá)，弱陽性22例;另外，LSD1的表達(dá)水平與腫瘤頸淋巴結(jié)(P=0.0329)、臨床分期（P=0.0346）及總體生存率（P=0.0447）有關(guān);多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)LSD1的表達(dá)水平是影響患者總體預(yù)后的獨(dú)立因素之一(P=0.028)。③在DMBA誘導(dǎo)的金黃地鼠頰癌病變進(jìn)展的不同階段，標(biāo)本中LSD1的表達(dá)水平逐漸增高。④應(yīng)用siRNA能有效抑制口腔鱗癌細(xì)胞中的LSD1表達(dá);LSD1沉默后癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體外克

8、隆成球能力被抑制，而細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo);將LSD1沉默細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞移植至裸鼠皮下發(fā)現(xiàn)成瘤能力未見明顯差異，而LSD1沉默細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)顯著慢于對(duì)照組移植瘤。⑤PG和TCP能在體外有效抑制口腔鱗癌細(xì)胞中的LSD1表達(dá)，并呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng);PG和TCP體外干預(yù)后，抑制細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。⑥對(duì)裸鼠口腔鱗癌異位移植瘤模型進(jìn)行PG和TCP化學(xué)干預(yù)后，顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)，以及移植瘤中LSD1、Ki67的表達(dá)。
　　結(jié)論：