NOB1在人喉鱗狀細(xì)胞癌中的生物學(xué)行為及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究分別采用Real-time PCR，westem blot方法檢測喉癌和癌旁正常組織NOB1 mRNA及蛋白的表達(dá)差異，然后應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)使NOB1基因沉默，研究NOB1基因在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，從細(xì)胞學(xué)水平上探討NOB1基因干擾對喉癌細(xì)胞增殖，凋亡，遷移及侵襲能力的影響以及NOB1基因是否與MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)。本課題的研究結(jié)果會(huì)幫助人們了解NOB1對喉癌的

2、作用及機(jī)制，為喉癌的診斷提供新的線索，為其治療提供新的分子靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、臨床樣本的收集
　　收集自2014年1月至2015年1月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科行手術(shù)治療的30例原發(fā)喉癌患者標(biāo)本，術(shù)前均未接受放化療。在喉癌手術(shù)過程中收集喉癌組織，經(jīng)病理診斷證實(shí)為喉鱗狀細(xì)胞癌，對照黏膜均來自于喉全切除患者腫瘤邊緣2厘米以上的喉黏膜，經(jīng)病理證實(shí)為正常黏膜。標(biāo)本收集后，馬上標(biāo)記好迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，取得

3、的標(biāo)本放入-80℃冰箱進(jìn)行保存。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系購自中國生命科學(xué)院上海研究所，在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2的飽和濕度條件下。
　　3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　NOB1 shRNA（短發(fā)夾RNA）的序列及其陰性對照序列通過上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（上海）合成后分別插入到pRNA-H1.1質(zhì)粒載體，經(jīng)測序驗(yàn)證，并分別命名為NOB1 sh

4、RNA及陰性對照質(zhì)粒(NC質(zhì)粒)。Hep2細(xì)胞接種于6孔板，將NOB1 shRNA及NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000（Invitrogen，美國），轉(zhuǎn)染操作依照說明書進(jìn)行。Hep2細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后用10％胎牛血清及100 ug/ml G418（Invitrogen，美國）的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞克隆。
　　4、Real-time PCR法檢測組織標(biāo)本中NOB1的表達(dá)

5、>　　用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及(dT)15將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，NOB1mRNA水平用SYBR Green染料定量PCR檢測。
　　5、Western blot半定量法檢測NOB1在組織標(biāo)本和細(xì)胞中的表達(dá)
　　按常規(guī)方法提取總蛋白，蛋白定量后，進(jìn)行western blot，結(jié)果應(yīng)用成像軟件Gel-Pro-Analyzer進(jìn)行灰度分析。
　　6、MTT實(shí)驗(yàn)

6、　　將細(xì)胞接種在96孔板中，密度3×103個(gè)/孔，在0h、24h、48h、72 h和96 h于每孔中加入MTT，孵育4h。吸出上清液，每孔中加入DMSO200μl，酶標(biāo)儀檢測490nm波長處的OD值。
　　7、克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿500個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)皿置于37?！媾囵B(yǎng)一周可見克隆，每2-3天更換培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)可見克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，4％的多聚甲醛固定，再用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染

7、色液(Wright-Giemsa)染色5min，拍照并計(jì)算克?。?xì)胞數(shù)大于50的克隆）形成率。
　　8、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)
　　通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。先收獲細(xì)胞，用PBS洗滌數(shù)次，再用70％冰乙醇固定。固定后的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞周期檢測試劑盒染色，37?！姹芄夥跤?0 min，流式細(xì)胞儀分析各個(gè)細(xì)胞周期。
　　9、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
　　通過細(xì)胞凋亡試劑盒檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，用流式細(xì)胞儀分析。首先收集單細(xì)胞懸液，離心棄上清

8、后重懸于500ul結(jié)合緩沖液，然后向懸浮液中加入5μlAnnexinⅤ-FITC及碘化丙啶，在室溫避光條件下孵育15min后，用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　10、Hoechst染色
　　將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板，37。℃培養(yǎng)24 h后固定，PBS洗滌數(shù)次后用Hoechst染色試劑盒染色，熒光顯微鏡鏡檢，調(diào)節(jié)熒光顯微鏡為400×，拍照。
　　11、創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)
　　將細(xì)胞接種在6孔板

9、中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％-90％的匯合度時(shí)用絲裂霉素C處理1h，再用200μl槍頭在單層細(xì)胞表面制造劃痕。然后用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，分別在0h，24h和48h記錄劃痕位置，于顯微鏡下觀察并拍照，通過劃痕間距來計(jì)算細(xì)胞遷移率，即細(xì)胞遷移率=（1-24h或48h的劃痕間距/0 h的劃痕間距）×100％。
　　12、Transwell小室實(shí)驗(yàn)
　　Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染NOB1 shRNA后24h，制備細(xì)胞懸浮液，取200μl細(xì)胞懸浮

10、液注入Transwell小室的上室，上室?guī)в腥斯せ啄せ|(zhì)膠，注入細(xì)胞為2×104個(gè)/孔。下室加入含20％胎牛血清的FBS培養(yǎng)基，在37℃條件下孵育24h，清掉上室的細(xì)胞，下室的細(xì)胞經(jīng)4％多聚甲醛于固定，用0.5％的結(jié)晶紫染色5min，200×顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
　　13、使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以所有數(shù)據(jù)使用mean(x)±standard deviation(SD)來表示，差異比較

11、采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，各組間采用單因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni's Multiple Comparison進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、NOB1在喉癌及癌旁對照組織中的表達(dá)
　　Western blot及Real-time PCR結(jié)果顯示NOB1蛋白和NOB1 mRNA在喉癌組織中的表達(dá)高于喉癌旁對照組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明NOB1參與了喉癌

12、的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　2、NOB1 shRNA后NOB1表達(dá)水平
　　通過NOB1 shRNA探索了NOB1基因的功能，分別以qPCR和Western blot檢測了NOB1 shRNA的干擾效果。qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NOB1 shRNA的細(xì)胞其NOB1表達(dá)水平減少至27±4％，然而陰性對照組的NOB1表達(dá)水平無顯著改變。Western blot結(jié)果與qPCR相似，轉(zhuǎn)染NOB1 shRNA的細(xì)胞其NOB1蛋白水平減少為2

13、2±4％。這些結(jié)果表明NOB1 shRNA可以使NOB1基因的表達(dá)下調(diào)。
　　3、NOB1 shRNA后喉癌細(xì)胞的增殖情況
　　采用集落形成試驗(yàn)探索了NOB1對喉癌細(xì)胞增殖的影響。NOB1 shRNA轉(zhuǎn)染組和NC組相比，克隆形成率明顯降低(p＜0.01)。MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，NOB1 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯比NC組減慢。這些結(jié)果提示，抑制NOB1能夠抑制喉癌細(xì)胞的生長。
　　流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果，

14、轉(zhuǎn)染NOB1 shRNA后，G1期的細(xì)胞百分比從57.90±0.36％增加到72.10±1.06％，G2期的細(xì)胞百分比從24.90±0.35％降低至11.45±2.55％，轉(zhuǎn)染NOB1 shRNA后，細(xì)胞周期的分布發(fā)生改變，表明NOB1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用。
　　4、NOB1 shRNA后喉癌細(xì)胞的凋亡情況
　　流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測了轉(zhuǎn)染NOB1 shRNA對細(xì)胞凋亡情況的影響。結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞凋亡百分比為4.53

15、±0.42％，但NOB1 shRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡百分比增加至20.70±0.96％。Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡情況，NOB1 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)核固縮現(xiàn)象。本研究還檢測cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平。Western blot的結(jié)果顯示，cleaved caspase-3蛋白水平增加了3.09±0.37倍，cleaved PARP蛋白水平增加了2.2±

16、0.4倍，Bax蛋白表達(dá)水平增加了1.87±0.19倍，但是Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低至49±10％，這些結(jié)果闡明沉默NOB1誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡。
　　5、NOB1 shRNA對喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響
　　創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了NOB1 shRNA后的24h和48h，細(xì)胞遷移能力明顯下降。Transwell小室實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，NOB1 shRNA轉(zhuǎn)染組通過微孔膜的細(xì)胞數(shù)量（72.2±7.46）顯著低于NC組（119

17、.4±12.9）。Western blot檢測MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示NOB1 shRNA轉(zhuǎn)染組的MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平分別降低至64±7％和52±7％，顯著低于NC組。這些結(jié)果闡明下調(diào)NOB1可以抑制喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論：
　　1、NOB1基因在喉鱗癌組織中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，表明喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中，NOB1基因可能發(fā)揮了重要的作用;
　　2、抑制NOB1基因的表達(dá)能夠抑