白血病兒童骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及其生物學特性和免疫調(diào)節(jié)功能的初步研究.pdf

1、目的:通過體外實驗研究白血病兒童骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的生物學特性及其免疫調(diào)節(jié)作用，從而探討白血病兒童骨髓來源的MSCs在白血病兒童化療后實行自體回輸?shù)目尚行约翱赡艹霈F(xiàn)的免疫重建作用。 方法:通過Ficoll-Hypaque梯度密度離心法分離出白血病兒童骨髓單個核細胞，貼壁法體外純化擴增MSCs，獲得第3～4（P3～4）代細胞用于實驗。光鏡觀察細胞生長形態(tài)，瑞氏染色觀察細

2、胞核漿比例及形態(tài)，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測免疫表型，油紅O染色及茜素紅染色檢測其向脂肪及骨細胞分化等觀察其生物學特性。取外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PB-MNCs），用植物凝集素（PHA）及白細胞介素2（IL-2）進行刺激后將MSCs按照不同比例（1/5～1/1000）加入MNCs中，進行細胞相互接觸的共培養(yǎng)、transwel

3、l體系的細胞非接觸性共培養(yǎng)，在培養(yǎng)第5天后收集懸浮細胞，用LDH法檢測各組中MNCs的增殖情況，用ELISA方法檢測單獨MNCs、加入不同比例的MSCs與MNCs接觸共培養(yǎng)體系中各組干擾素-γ（IFN-γ）和穿孔素（perforin）的分泌情況，再用流式細胞術(shù)分析單獨MNCs、不同比例MSCs：MNCs接觸共培養(yǎng)體系中T細胞亞群CD3、CD4、CD8及調(diào)節(jié)性T細胞CD4、CD25的免疫表型表達情況。 結(jié)果:白血病兒童骨髓來源的M

4、SCs在光鏡下觀察，呈梭形，并平行排列成漩渦狀生長，瑞氏染色可見其胞核較大，細胞傳代后3d內(nèi)處于潛伏期，3d后進入生長期，8d后進入平臺期。MSCs表達CD29、CD105、CD13，不表達CD34、CD45、HLA-DR、CD14。在相應(yīng)的誘導條件下，可以向脂肪及骨細胞分化，油紅O染色及茜素紅染色呈陽性。在MSCs與MNCs細胞相互接觸共培養(yǎng)體系中，當MSCs：MNCs>1：100時，MSCs能抑制PHA和IL-2刺激的MNCs的增殖

5、，隨MSCs數(shù)量增加，抑制作用更加明顯；隨MSCs數(shù)量減少，MSCs對PHA和IL-2刺激的MNCs的增殖抑制作用減弱，當MSCs：MNCs≤1：100時，MSCs在一定程度上可促進MNCs的增殖；而Transwell非接觸性共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠促進MNCs的增殖。MSCs與MNCs不同比例共接觸培養(yǎng)后檢測IFN-γ及perforin的分泌，MSCs：MNCs=1：10時對細胞因子的分泌與受IL-2+PHA刺激后單獨MNCs培

6、養(yǎng)相比明顯下降。檢測接觸共培養(yǎng)體系中淋巴細胞亞群比例改變結(jié)果顯示，各組CD3+CD4+比例無明顯改變；當MSCs：MNCs>1：100時，CD3+CD8+比例減少，CD4+CD25+hi比例升高；而當MSCs：MNCs=1：1000時，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+CD25+hi比例與單獨MNCs培養(yǎng)時比例無明顯差異。 結(jié)論:①白血病患兒骨髓培養(yǎng)出的貼壁細胞是MSCs，骨髓含量在1ml以上且方法得當可以培養(yǎng)出MSC

7、s。②初診的白血病患兒的骨髓相對容易培養(yǎng)出骨髓MSCs，且在體外擴增速度較快。③白血病兒童來源的MSCs具有MSCs的共同生物學特性。④MSCs在體外對MNCs增殖的影響具有兩面性，而且呈劑量依賴性。在一定比例內(nèi)（本研究MSCs：MNCs>1：100時），MSCs對MNCs增殖的抑制作用隨著MSCs加入的濃度升高而增強；當MSCs與MNCs小于一定比例（本研究MSCs：MNCs≤1：100）時，MSCs的抑制作用減少，有可能促進MNCs