急性白血病兒童骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與臍血來源NK細(xì)胞的相互作用體內(nèi)外初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中除了造血干細(xì)胞外的另一種成體干細(xì)胞。MSCs不僅在體外可培養(yǎng)無限擴(kuò)增而不喪失其多向分化潛能[1]，并且具有支持造血及免疫調(diào)節(jié)的功能，被越來越多地應(yīng)用于血液腫瘤等惡性疾病的治療，同時(shí)在再生醫(yī)學(xué)及組織工程中也有廣泛應(yīng)用前景。目前應(yīng)用于臨床的或者進(jìn)行臨床試驗(yàn)的骨髓MSCs包括異基因骨髓MSCs及自體骨髓MSCs。然而，研究發(fā)現(xiàn)異基因骨髓MSCs歸巢困難[3]，而自體的MSCs可有效歸巢且自體的

2、MSCs安全性高，經(jīng)自體MSCs輸注感染傳染病的機(jī)會(huì)少，因此人們也把更多的注意力放在自體的骨髓MSCs身上。對于白血病兒童來說，臨床應(yīng)用的自體MSCs都是在白血病狀態(tài)下采集，這種異常狀態(tài)下的骨髓MSCs回輸是否安全呢？吳麗萍等人的研究結(jié)果表明，白血病患兒的骨髓MSCs在生物學(xué)特性方面與其他來源的骨髓MSCs無明顯差異。但是白血病兒童骨髓MSCs在分子水平及功能學(xué)上是否有改變是值得深入研究的。尤其是在功能學(xué)上的研究不可忽視，例如：白血病兒

3、童骨髓MSCs是否會(huì)有惡性選擇及促進(jìn)白血病復(fù)發(fā)的作用呢？是否會(huì)減弱NK、T細(xì)胞等免疫因子的GVL效應(yīng)及清除MRD的能力而增加白血病的復(fù)發(fā)率？這些疑問的解決是白血病兒童自體骨髓MSCs安全應(yīng)用的前提。
　　 NK細(xì)胞作為機(jī)體天然免疫的重要組成部分，是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。隨著對NK細(xì)胞生物功能及活化機(jī)制的了解，NK細(xì)胞在造血干細(xì)胞/骨髓移植的輔助治療及腫瘤過繼性免疫治療方面的作用倍受關(guān)注。然而，原始來源的NK細(xì)胞含量

4、少，且目前尚缺乏有效的體外擴(kuò)增體系，所以NK細(xì)胞的廣泛臨床應(yīng)用受到了限制。因此，探索NK細(xì)胞的體外高效擴(kuò)增體系具有重要意義。
　　 我們在本課題組之前對白血病兒童骨髓MSCs細(xì)胞的生物學(xué)特性初步研究的基礎(chǔ)上，分離純化擴(kuò)增臍血NK細(xì)胞，并采用NOD/SCID小鼠建立白血病模型，對白血病兒童骨髓MSCs與NK細(xì)胞的相互作用及對白血病細(xì)胞K562的影響進(jìn)行體內(nèi)外的初步研究，為急性白血病兒童骨髓MSCs及臍血NK細(xì)胞在白血病免疫治療中應(yīng)

5、用的后續(xù)研究做前哨性的探索。
　　 目的：探討從人臍血中分選及擴(kuò)增高純度NK細(xì)胞的優(yōu)化技術(shù)、擴(kuò)增前后其功能的變化；以及在本課題組前期研究急性白血病兒童骨髓MSCs的生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上，探討急性白血病兒童骨髓MSCs與臍血NK細(xì)胞在體外的可能相互作用。同時(shí)采用NOD/SCID小鼠建立荷K562白血病模型，探索急性白血病兒童骨髓MSCs在體內(nèi)對K562腫瘤細(xì)胞生長的影響及對NK細(xì)胞抗瘤作用的影響。本研究旨在為兒童白血病綜合治療中應(yīng)用

6、自體MSCs或者聯(lián)合應(yīng)用NK細(xì)胞清除MRD的潛在應(yīng)用價(jià)值做基礎(chǔ)性的探索。
　　 方法：先用miniMACS及陽性免疫磁珠分選方法，從臍血單個(gè)核細(xì)胞得到純化的NK細(xì)胞，隨后通過IL-2、IL-12和IL-15三個(gè)細(xì)胞因子的不同組合將培養(yǎng)體系分為IL-2組、IL-2+IL-l2組、IL-2+IL-l5組、IL-12+IL-l5組、IL-2+IL-l5+Il-l2組及對照組，分別培養(yǎng)15天，每3天半量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子；檢測分選及擴(kuò)增

7、前后CD3-CD56++16+NK細(xì)胞含量、擴(kuò)增倍數(shù)及擴(kuò)增前后各組NK細(xì)胞對K562殺傷率的變化。參照吳麗萍等人[5]的方法，通過Ficoll-Hypaque梯度密度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法體外純化擴(kuò)增急性白血病兒童骨髓MSCs，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、免疫表型及多向分化能力的鑒定；取P3細(xì)胞用于后續(xù)研究。隨后按照不同的MSCs︰NK比例，采用直接接觸共培養(yǎng)及Transwell培養(yǎng)兩種體系進(jìn)行急性白血病兒童骨髓MSCs與臍血NK細(xì)胞的相互作用體外研究

8、。出于偶然的發(fā)現(xiàn)，其中在MSCs︰NK比例相同的條件下，均設(shè)置了對應(yīng)的IL2預(yù)先處理MSCs的實(shí)驗(yàn)組。兩者相互作用7天后的檢測指標(biāo)有：細(xì)胞形態(tài)、NK細(xì)胞增殖率、對K562細(xì)胞的殺傷活性及細(xì)胞因子分泌水平，檢測方法主要采用CCK-8試劑盒及ELISA。最后，采用NOD/SCID小鼠，先腹腔注射環(huán)磷酰胺預(yù)處理24小時(shí)后，尾靜脈輸注K562細(xì)胞或同時(shí)K562細(xì)胞與MSCs聯(lián)合輸注建立白血病模型；2周左右白血病小鼠出現(xiàn)癥狀后給予尾靜脈輸注NK細(xì)

9、胞或者聯(lián)合輸注MSCs與NK細(xì)胞；從生存期分析、病理檢查等方面研究急性白血病兒童骨髓MSCs在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)對K562腫瘤細(xì)胞生長的影響及對臍血NK細(xì)胞抗瘤作用的影響。
　　 結(jié)果：純化前，流式細(xì)胞術(shù)檢測CB-MNC中CD3-CD56++16+細(xì)胞含量為14.85±9.1，免疫磁珠純化后，CD3-CD56++16+細(xì)胞含量為92.1±1.1；臍血中的NK細(xì)胞含量由純化前的14.85±9.1％提高到92.1±1.1％，每份標(biāo)本分離得

10、到的NK細(xì)胞純度均＞90％。擴(kuò)增培養(yǎng)期內(nèi)臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞存活率均為95％以上。培養(yǎng)前5天，各組細(xì)胞增殖均較緩慢；最快增殖時(shí)間出現(xiàn)在培養(yǎng)第2周，即第7-15天，此階段各組培養(yǎng)條件下NK細(xì)胞均較培養(yǎng)初期顯著擴(kuò)增。培養(yǎng)至第15天IL-2組、IL-2+IL-12組、IL-2+IL-15組、IL-15+IL-l2組、IL-2+IL-15+IL-l2組 NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為15.51±1.09，24.01±3.81，51.45±4.36，20.

11、01±3.88及53.34±6.76，均顯著高于對照組的1.64±1.0，IL-2+IL-15組、IL-2+IL-15+IL-l2組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)顯著高于IL-2組、IL-15+IL-l2組及IL-2+IL-12組。其中對照組NK細(xì)胞在培養(yǎng)第15天細(xì)胞數(shù)較前下降，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞狀態(tài)差，死亡細(xì)胞增多。各細(xì)胞因子組NK細(xì)胞殺傷活性均較擴(kuò)增前明顯增強(qiáng)，NK細(xì)胞對K562殺傷活性呈IL-2+IL-15組＞IL-2+IL-12組＞IL-15

12、+IL-l2組＞IL-2組，且IL-2+IL-15組與IL-2+IL-15+IL-l2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著效靶比從1︰1、5︰1到10︰1，各組NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率均逐步提高。培養(yǎng)的白血病兒童BM-MSCs在光鏡下觀察，呈梭形，平行排列漩渦狀生長；不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)抗原CD34、CD45，而CD29、CD105及CD13則陽性表達(dá)；在相應(yīng)的誘導(dǎo)體系下，該MSCs可以向脂肪及骨細(xì)胞分化，油紅O染色及西素紅染色陽性。MSCs與

13、NK細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSCs抑制NK細(xì)胞的增殖，其抑制作用呈劑量依賴性，但I(xiàn)L2預(yù)先刺激24小時(shí)的MSCs細(xì)胞對NK細(xì)胞增殖的抑制作用明顯減低，當(dāng)MSCs︰NK比例為1︰100時(shí)，這種抑制作用基本消失；在直接相互接觸共培養(yǎng)及Transwell培養(yǎng)體系中均觀察到這種相同現(xiàn)象，但Transwell培養(yǎng)體系的抑制作用明顯減低，這提示MSCs對NK細(xì)胞增殖的抑制作用可能需要MSCs與NK細(xì)胞的相互直接接觸而實(shí)現(xiàn)。與IL-2培養(yǎng)體系單獨(dú)

14、培養(yǎng)的NK細(xì)胞相比，與MSCs共培養(yǎng)的NK細(xì)胞的殺傷活性受到了抑制，但是在對應(yīng)的IL-2預(yù)先處理的MSCs共培養(yǎng)組，這種抑制作用明顯減弱。實(shí)驗(yàn)顯示，MSCs對NK細(xì)胞殺傷活性的抑制作用呈劑量相關(guān)。直接相互接觸共培養(yǎng)與Transwell培養(yǎng)組的結(jié)果無明顯差異，這在一定程度上提示MSCs對NK細(xì)胞殺傷活性的抑制可能是通過可溶性因子介導(dǎo)的。MSCs可以抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ、perforin，且抑制作用呈劑量依賴性，直接相互接觸共培養(yǎng)與T

15、ranswell培養(yǎng)的結(jié)果無明顯區(qū)別，但是，IL-2預(yù)先處理過的MSCs組NK細(xì)胞的IFN-γ、perforin分泌水平相對高于未處理組；由此可以看出，MSCs對免疫細(xì)胞的抑制作用是可調(diào)控的。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用miniMACS免疫磁珠陽性分選可從人臍血中獲得高純度NK細(xì)胞；在細(xì)胞因子存在的合適培養(yǎng)體系中可進(jìn)行有效擴(kuò)增。聯(lián)合應(yīng)用IL-2+IL-15兩種細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系，可有效的擴(kuò)增NK細(xì)胞，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞

16、毒活性及細(xì)胞因子分泌水平。
　　 2.急性白血病兒童骨髓MSCs對臍血NK細(xì)胞增殖具有抑制作用，呈劑量依賴性，且細(xì)胞間的相互接觸是參與這種抑制作用的主要機(jī)制之一。
　　 3.急性白血病兒童骨髓MSCs對臍血NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性具有抑制作用，呈劑量依賴性，且這種抑制作用主要通過可溶性因子介導(dǎo)。
　　 4.急性白血病兒童骨髓MSCs對臍血NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌具有抑制作用，呈劑量依賴性，且這種抑制作用主要通過可溶性因子介

17、導(dǎo)。
　　 5.急性白血病兒童骨髓MSCs對臍血NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用是可調(diào)控的，可受到IL-2或其它因素的影響而改變。
　　 6.采用NOD/SCID小鼠，環(huán)磷酰胺2mg/只腹腔注射預(yù)處理后尾靜脈移植K562腫瘤細(xì)胞可成功建立白血病動(dòng)物模型。
　　 7.急性白血病兒童骨髓MSCs與K562腫瘤細(xì)胞共移植至NOD/SCID小鼠，其在體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的現(xiàn)象。
　　 急性白血病兒童骨髓MSCs與臍