人臍帶間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、第一部分:人臍帶間充質(zhì)干細胞與外周血單個核細胞的相互作用:IL-1β、TNF-α、IFN-γ與細胞死亡
　　背景:間充質(zhì)干細胞因其具有長期體外擴增、多項分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用，成為用于細胞基礎(chǔ)的組織修復(fù)和自身免疫性疾病治療極有前景的種子細胞。臍帶間充質(zhì)干細胞分離自臍帶，與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，其涉及倫理問題較少。并且與分離自其他成體組織的間充質(zhì)干細胞相比，相對更原始，是一種介于胚胎干細胞和成體干細胞間的一種細胞。臍帶間充質(zhì)干細胞易

2、于分離、增殖能力強、不會誘發(fā)畸胎瘤并具有較強的免疫抑制能力，因此，臍帶間充質(zhì)干細胞成為一種更有應(yīng)用前景的間充質(zhì)干細胞。另一方面，近期研究報道，間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用并不是固有的，其免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮與所處的微環(huán)境密切相關(guān)。目前人們對微環(huán)境對MSCs免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮的研究相對較少。
　　目的:我們前期研究發(fā)現(xiàn)，單個核細胞(PBMCs)產(chǎn)生IL-1β參與hUC-MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，在本研究中，我們致力于研究在MSCs病理

3、生理和治療條件下與其密切相關(guān)的PBMCs對MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響及其機制。
　　方法:(1)分離臍帶間充質(zhì)干細胞，并行流式細胞術(shù)進行免疫表型鑒定。(2)在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，經(jīng)茜素紅染色和油紅O染色，進一步鑒定間充質(zhì)干細胞三系分化能力。(3)建立PBMC CM刺激hUC-MSCs最佳培養(yǎng)條件，并利用最佳培養(yǎng)條件，比較hUC-MSCs與BM-MSCs與PBMCs CM作用后表達細胞因子的差異。同時通過檢測不同培養(yǎng)上清中相關(guān)細胞因子含

4、量，尋找PBMCs對hUC-MSCs作用的重要細胞因子。(4)應(yīng)用重組細胞因子IL-1β、TNF-α以及相關(guān)信號通路抑制劑(LY2940002、JNK inhibitorⅡ、BAY11-7082、SC-514、U0126、SB203580)作用細胞，通過檢測IL-6與MCP-1的表達比較IL-1β與TNF-α對hUC-MSCs表達細胞因子的差異。(5)應(yīng)用重組細胞因子TNF-α、IFN-γ、TRAIL以及FasL，分別通過CellTit

5、er Glo(R)Luminescent Cell Viability Assay以及PI和FITC-Annexin雙染觀察不同細胞因子對hUC-MSCs死亡的作用，并同時檢測上清中IL-6與MCP-1的表達，研究細胞死亡與細胞因子分泌的關(guān)系。在部分實驗中，加入pan-caspase抑制劑zVAD-fmk(V，20μM)或RIP1抑制劑necrostatin-1(N，50μM)，研究不同細胞因子誘導(dǎo)hUC-MSCs細胞死亡的機制。(6)

6、應(yīng)用凋亡蛋白抑制蛋白小分子拮抗劑GDC-0152處理經(jīng)TNF-α刺激的hUC-MSCs，分別行共聚焦染色、分別提取細胞核與細胞漿進行免疫印跡，同時收集處理細胞上清行IL-6與MCP-1檢測，探討TNF-α促進hUC-MSCs分泌細胞因子的機制。
　　結(jié)果:(1)人臍帶間充質(zhì)干細胞表達CD44、CD73、CD90和CD105，不表達CD34、CD19、CD31、CD45以及HLA-DR（HLA-Ⅱ類分子）。在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，具有

7、三系分化的能力，符合國際細胞治療協(xié)會間充質(zhì)與組織干細胞委員會規(guī)定的基本標(biāo)準(zhǔn)。(2)5×104/ml PBMCs培養(yǎng)24小時后的條件培養(yǎng)上清具有最佳的刺激效果，在后續(xù)PBMC CM刺激實驗中，均采用這一培養(yǎng)體系。(3) hUC-MSCs經(jīng)PBMC CM刺激所表達的細胞因子與BM-MSCs相似，但其IL-1β和GM-CSF的表達量高于BM-MSCs。(4)在PBMCs通過可溶性細胞因子對MSCs的作用中，IL-1β是主要的調(diào)節(jié)因子，TNF-

8、α亦參與hUC-MSCs細胞因子的表達。并且IFN-γ可增強以上兩種因子對hUC-MSCs相關(guān)細胞因子的分泌。此外，PBMCs分泌TNF-α受IL-1β的調(diào)控。(5)高濃度的TNF-α可誘導(dǎo)hUC-MSCs發(fā)生死亡。死亡受體配體FasL本身以及與TNF-α聯(lián)合使用并不誘導(dǎo)hUC-MSCs死亡，但是TRAIL可增強TNF-α誘導(dǎo)的細胞死亡。并且IFN-γ亦可增強TNF-α誘導(dǎo)的細胞死亡，但其與TRAIL作用的機制不同。當(dāng)TNF-α與TRA

9、IL聯(lián)合使用時，主要通過凋亡導(dǎo)致細胞死亡;而當(dāng)IFN-γ與TNF-α聯(lián)合使用時，主要通過壞死導(dǎo)致細胞死亡。(6) TNF-α刺激hUC-MSCs分泌MCP-1和IL-6部分與細胞死亡間接相關(guān)，并且與凋亡蛋白抑制蛋白依賴的NF-kB活化相關(guān)。
　　結(jié)論:在PBMCs可溶性細胞因子對hUC-MSCs的作用中，IL-1β和TNF-α是兩個重要的細胞因子。其中，IL-1β是這一作用的主要細胞因子，并可促進PBMCs分泌TNF-α。低濃度的

10、TNF-α有助于hUC-MSCs分泌IL-6與MCP-1。當(dāng)TNF-α濃度增加或與TRAIL和IFN-γ聯(lián)用時，TNF-α可誘導(dǎo)hUC-MSCs死亡，且與IL-6以及MCP-1的分泌相關(guān)。高濃度TNF-α促進hUC-MSCs分泌細胞因子與IAPs依賴的NF-kB信號通路活化相關(guān)。明確局部微環(huán)境中這些重要因子的相互作用有利于了解MSCs在維持組織穩(wěn)態(tài)中的生理與病理作用。
　　第二部分:人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)CD4+Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)

11、揮其免疫調(diào)節(jié)作用
　　背景:間充質(zhì)干細胞因其具有免疫調(diào)節(jié)作用而被廣泛用于治療免疫相關(guān)疾病。人臍帶間充質(zhì)干細胞因其具有易于取材、體外擴增速度快且無倫理問題，成為一種具有較好前景的臨床治療細胞。間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮與可溶性細胞因子、細胞細胞間直接接觸以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生均相關(guān)。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，Tr1是一種高表達IL-10，不表達Foxp3，具有較強免疫調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性T細胞。目前尚不清楚，hUC-MSCs對這類調(diào)節(jié)性

12、T細胞的作用。
　　目的:通過hUC-MSCs與PBMCs共培養(yǎng)體系，探討Tr1產(chǎn)生在hUC-MSCs免疫調(diào)節(jié)中的作用及其機制。
　　方法:(1)應(yīng)用流式細胞術(shù)對分離的人臍帶間充質(zhì)干細胞進行表型分析。并在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，行茜素紅染色與油紅O染色，觀察其成骨與成脂能力，鑒定MSCs。(2)建立共培養(yǎng)和transwell培養(yǎng)體系。將生長狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細胞以105-2×105/well接種于6孔板，待細胞貼壁后，經(jīng)X光照射(5

13、4Gy)抑制其增殖。隨后以PBMCs與MSCs比例為10∶1的比例加入健康人新鮮分離的PBMCs進行共培養(yǎng)。在有些實驗組加入5μg/ml的植物血凝素，用于刺激PBMCs。(3)培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，加入PE-antiCD4(Sk3，1∶100)、FITC-antiCD49b(AK7，4∶100)、APC-antiLAG3(FAB2319A,4∶100)以及preCP-Cy5.5-antiCD45RA(MI100,1∶100)抗體對細胞進

14、行染色，經(jīng)流式細胞術(shù)分析hUC-MSCs誘導(dǎo)Tr1產(chǎn)生情況。(4)將培養(yǎng)結(jié)束后的細胞經(jīng)流式細胞儀進行分選，分別收集CD49b-/LAG3-以及CD49b+/LAG3+的細胞，調(diào)整細胞密度，以105/孔接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集上清，進行IL-10 ELISA檢測。(5)收集共培養(yǎng)后細胞，進行細胞內(nèi)IL-10染色，確定分泌IL-10細胞的來源。
　　結(jié)果:(1)人臍帶間充質(zhì)干細胞表達CD44、CD73、CD90和CD10

15、5，不表達CD34、CD19、CD31、CD45以及HLA-DR（HLA-Ⅱ類分子），并在體外誘導(dǎo)條件下，具有三系分化的能力，符合見國際細胞治療協(xié)會間充質(zhì)與組織干細胞委員會規(guī)定的基本標(biāo)準(zhǔn)。(2)將PBMCs與hUC-MSCs共培養(yǎng)，hUC-MSCs可誘導(dǎo)Tr1的產(chǎn)生。無論PBMCs是否活化（經(jīng)植物血凝素刺激），與單獨PBMCs培養(yǎng)組相比，hUC-MSCs均可誘導(dǎo)Tr1產(chǎn)生(無PHA組，2.8±0.41 vs4.59±0.53; PHA刺

16、激組，3.107±0.19 vs.11.07±0.85，p＜0.05)。(3)通過transwell培養(yǎng)體系可見，hUC-MSCs誘導(dǎo)Tr1產(chǎn)生依賴于可溶性細胞因子，transwell組與對照組Tr1百分比無明顯差異(11.07±0.85 vs.10.60±0.47，P＞0.05)(4)通過分選LAG3+/CD49b+檢測IL-10表達進一步堅定hUC-MSCs誘導(dǎo)的Tr1。結(jié)果表明，LAG3+/CD49b可作為Tr1鑒定與分選的標(biāo)志。