精氨酸酶調(diào)控奶牛乳腺中酪蛋白合成的分子機(jī)制.pdf

1、課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成具有促進(jìn)作用，并且對(duì)精氨酸代謝相關(guān)酶活力也有顯著影響。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)通過向奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同精氨酸代謝相關(guān)酶抑制劑，分別抑制精氨酸的不同代謝通路，并檢測(cè)細(xì)胞中酪蛋白濃度，篩選出精氨酸調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白表達(dá)的關(guān)鍵途徑。接著在乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中通過補(bǔ)充代謝底物和代謝產(chǎn)物的方法，對(duì)篩選出的關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行驗(yàn)證。最后，在泌乳中期的荷斯坦奶牛上，通過頸靜脈灌注關(guān)鍵的精

2、氨酸代謝相關(guān)酶抑制劑，并測(cè)定奶牛乳中酪蛋白濃度，乳成分、產(chǎn)奶量、飼料中養(yǎng)分的消化率以及血液指標(biāo)等。旨在探討精氨酸調(diào)控奶牛乳腺中酪蛋白合成的關(guān)鍵代謝通路，以期為牛奶中乳蛋白提高，乳品質(zhì)的改善提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　試驗(yàn)1:選擇Nω-hydroxy-nor-Arginine(Cayman，nor-NOHA，10006861)作為精氨酸酶特異性抑制劑;二氟甲基鳥氨酸2-(difluoromethyl)ornithine(Sigma，

3、DFMO，D193)作為鳥氨酸脫羧酶抑制劑以及S-(2-氨乙基)異硫脲二氫溴酸鹽2-(2-Aminoethyl) isothiourea dihydrobromide(Sigma，A5879)作為一氧化氮合酶抑制劑。添加不同抑制劑培養(yǎng)后，分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞中精氨酸代謝相關(guān)酶活力，及細(xì)胞中酪蛋白合成的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加nor-NOHA和DFMO處理后的細(xì)胞增殖活力顯著降低(P＜0.05)，并且細(xì)胞中的酪蛋白濃度也有所降低(P＜0.

4、05)。而當(dāng)添加NOS酶抑制劑處理后，細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞中酪蛋白合成并沒有顯著變化。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果提示，精氨酸可能通過“精氨酸—鳥氨酸—多胺”代謝途徑調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成。
　　試驗(yàn)2:在試驗(yàn)1的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)2分別向培養(yǎng)基中添加nor-NOHA、nor-NOHA+Orn，nor-NOHA+Arg處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞增殖，細(xì)胞中精氨酸代謝相關(guān)酶活力及基因表達(dá)量，細(xì)胞中酪蛋白濃度及基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加nor

5、-NOHA處理后，細(xì)胞中總的精氨酸酶活力及精氨酸酶的基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，細(xì)胞的增殖活力有所下降(P＜0.05)，并且細(xì)胞中酪蛋白濃度及基因表達(dá)量也顯著降低(P＜0.05)。而當(dāng)補(bǔ)充精氨酸處理后，細(xì)胞的增殖活力，細(xì)胞中精氨酸代謝相關(guān)酶活力和酪蛋白合成并沒有顯著變化(P＞0.05)。但是當(dāng)向培養(yǎng)基中補(bǔ)充鳥氨酸處理后，細(xì)胞的增殖活力有所上升(P＜0.05)，并且上皮細(xì)胞中酪蛋白濃度也均有所恢復(fù)(P＜0.05)。體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

6、初步提示“精氨酸—烏氨酸”代謝通路是調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的關(guān)鍵通路。
　　試驗(yàn)3:在泌乳中期的荷斯坦奶牛中，通過頸靜脈灌注nor-NOHA，nor-NOHA+Arg后，檢測(cè)奶牛血液中精氨酸代謝相關(guān)酶活力，泌乳奶牛產(chǎn)奶量，乳品質(zhì)，乳中酪蛋白濃度，乳腺中酪蛋白基因以及精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白基因表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頸靜脈灌注nor-NOHA后，奶牛血液中總精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活力顯著降低(P＜0.05)，而總的NO合酶的活力卻沒有顯

7、著變化(P＞0.05)，乳中乳蛋白率及乳脂率也有所降低(P＜0.05)，但是產(chǎn)奶量卻沒有變化(P＞0.05);此外乳中酪蛋白濃度及乳腺中酪蛋白基因表達(dá)量也有所下降(P＜0.05)，但是乳腺中精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白的基因表達(dá)量卻沒有顯著變化(P＞0.05)。而當(dāng)補(bǔ)充灌注精氨酸處理后，奶牛血液中總精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活力沒有顯著變化(P＞0.05)，但是總的NO合酶活力顯著上升(P＜0.05)，而乳中乳蛋白率，乳脂率和酪蛋白濃度卻沒有顯著變化

8、(P＞0.05)，此外當(dāng)補(bǔ)充灌注精氨酸后，奶牛乳腺中部分精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)量有了顯著上升(P＜0.05)，奶牛的產(chǎn)奶量也有所提高(P＜0.05)。動(dòng)物在體試驗(yàn)得出與體外細(xì)胞試驗(yàn)一致的結(jié)論，即精氨酸通過“精氨酸—鳥氨酸”代謝通路調(diào)控酪蛋白生成。
　　試驗(yàn)4:本試驗(yàn)主要是研究灌注nor-NOHA和nor-NOHA+Arg處理后，奶牛飼料消化率，奶牛體內(nèi)氮素循環(huán)以及奶牛血液指標(biāo)的變化。具體試驗(yàn)方法同試驗(yàn)3。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，灌注nor-

9、NOHA對(duì)飼料中養(yǎng)分的表觀消化率沒有顯著影響(P＞0.05)，但是尿氮的含量卻有所上升(P＜0.05)，而乳氮卻有所下降(P＜0.05)，并且血中尿素氮含量也有所上升(P＜0.05)。而當(dāng)補(bǔ)充灌注精氨酸后，飼料中粗脂肪的消化率有所提高(P＜0.05)，而尿氮、乳氮和血中尿素氮濃度均恢復(fù)至正常水平(P＞0.05)。此外，灌注nor-NOHA和nor-NOHA+Arg對(duì)奶牛血常規(guī)指標(biāo)和免疫球蛋白水平均沒有顯著影響(P＞0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果