精氨酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、該研究以體外培養(yǎng)的中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CCMEC)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究培養(yǎng)基中不同水平精氨酸(Arg)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究Arg影響酪蛋白合成的機(jī)制，分別從細(xì)胞增殖水平，乳酪蛋白基因、酪蛋白合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平等方面來進(jìn)行初步探討。旨在得出Arg影響乳酪蛋白合成的一般規(guī)律，篩選出酪蛋白最大合成量時(shí)Arg的濃度;揭示Arg影響酪蛋白合成的細(xì)胞分子機(jī)制，以為提高牛奶中乳蛋白含量、改善牛

2、奶質(zhì)量提供理論依據(jù)。研究包括四個(gè)部分:試驗(yàn)一奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　 該試驗(yàn)以健康的中國荷斯坦奶牛的泌乳期乳腺組織為試驗(yàn)材料，采用膠原酶消化法在體外培養(yǎng)得到奶牛乳腺上皮細(xì)胞，根據(jù)成纖維細(xì)胞和乳腺上皮對(duì)胰蛋白酶的敏感性不同進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化，對(duì)分離純化的細(xì)胞進(jìn)行傳代、凍存與復(fù)蘇。并對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性、免疫組織化學(xué)、生物學(xué)功能的鑒定。利用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，采用免疫組化法對(duì)上皮細(xì)胞特異性蛋白C

3、K-18的表達(dá)進(jìn)行鑒定，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)編碼酪蛋白合成的基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:分離得到的細(xì)胞呈鵝路石樣，細(xì)胞之間連接緊密且界限清晰，單層生長(zhǎng);細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形，具有明顯的潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期，細(xì)胞于第三天進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期于第七天進(jìn)入平臺(tái)期，符合一般的細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律;CK-18的免疫組化鑒定結(jié)果呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性，說明分離得到的細(xì)胞屬典型的上皮細(xì)胞;RT-PCR結(jié)果顯

4、示，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3基因在細(xì)胞內(nèi)均能有效的表達(dá)，說明分離得到的細(xì)胞具有乳腺上皮細(xì)胞的特異性生物功能。
　　 試驗(yàn)二精氨酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)酪蛋白合成的影響
　　 該試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯颗囵B(yǎng)基中不同水平的Arg對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)αS、β-酪蛋白合成的影響。試驗(yàn)采用單因素7水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以無Arg的培養(yǎng)基即Arg0倍組(0.00mg/L)為對(duì)照，Arg0.25

5、倍組(69.500mg/L)、0.5倍組(139.00mg/L)、1倍組(278.00mg/L)、2倍組(556.00mg/L)、4倍組(1112.00mg/L)、8倍組(2224.00mg/L)為試驗(yàn)處理組，采用ELISA雙抗夾心法對(duì)各個(gè)組的細(xì)胞內(nèi)αS、β-酪蛋白合成量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示:對(duì)于αS-酪蛋白，除了Arg0.25倍組與Arg8倍組，各處理組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，且在Arg2倍組時(shí)αs-酪蛋白的合成量達(dá)到最大

6、;對(duì)于β-酪蛋白，除了Arg0.25倍組，各個(gè)處理組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，且在Arg2倍組時(shí)β-酪蛋白的合成量達(dá)到最大。
　　 試驗(yàn)三精氨酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響
　　 該試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究培養(yǎng)基中不同水平的Arg對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞增殖活性的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)二。采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法繪制不同處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，采用噻唑藍(lán)(MTT)法分別檢測(cè)各個(gè)處理組的24h、

7、48h、72h的細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，各個(gè)處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈S形，在第三天達(dá)到指數(shù)期，第七天進(jìn)入平臺(tái)期，進(jìn)入平臺(tái)期后Arg2倍組的細(xì)胞數(shù)目高于其他各組;MTT結(jié)果顯示，24h時(shí)，Arg0.25-4倍組與對(duì)照組相比均差異顯著(P＜0.05);48h、72h時(shí)，Arg各組與對(duì)照組相比均差異顯著(P＜0.05)。說明精氨酸能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，且在Arg濃度為69.50-1112.00mg/L（0.25倍組-4倍組）時(shí)促增殖效果較

8、佳。
　　 試驗(yàn)四精氨酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)酪蛋白合成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 該試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究培養(yǎng)基中不同水平的Arg對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)編碼乳酪蛋白合成的基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3以及與乳蛋白合成有關(guān)的JAK2/STAT5、mTOR信號(hào)通路上相關(guān)基因JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBP1的表達(dá)的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)二。以GAPDH為內(nèi)參，采用R

9、eal-TimePCR技術(shù)檢測(cè)各個(gè)處理組的CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBP1基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:對(duì)于CSN1S2、CSN2、JAK2基因，除了Arg0.25倍組與Arg8倍組外，其他各處理組與對(duì)照組相比顯著上調(diào)其表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)于STAT5、mTOR基因，除了Arg8倍組外，各處理組與對(duì)照組相比顯著上調(diào)其表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)于S6K基因，除了Arg0.5

10、倍組外，其他各各處理組與對(duì)照組相比顯著上調(diào)其表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)于4EBP1基因，除了Arg0.25倍組外，其他各各處理組與對(duì)照組相比顯著下調(diào)其表達(dá)(P＜0.05);在Arg2倍組時(shí)，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K基因的相對(duì)表達(dá)達(dá)到最大且與其他各組差異顯著(P＜0.05)，而4EBP1基因的相對(duì)表達(dá)量最低且與其他各組差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果說明，Arg對(duì)編碼乳蛋白合成基因

11、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3的表達(dá)起著重要的促進(jìn)作用，適宜濃度的Arg能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3基因的表達(dá)，且當(dāng)體外細(xì)胞培養(yǎng)液中Arg濃度為556mg/L時(shí)，這四種酪蛋白基因的表達(dá)顯著上調(diào);Arg能夠激活細(xì)胞內(nèi)的JAK2/STAT5、mTOR通路從而促進(jìn)乳蛋白基因的表達(dá)，當(dāng)體外細(xì)胞培養(yǎng)液中Arg濃度為556mg/L時(shí)，JAK2、STAT5、mTOR、S6K基因的表達(dá)均上調(diào)，