特發(fā)性無精子癥患者的遺傳學(xué)表型、血清FSH及其受體與睪丸精子發(fā)生關(guān)系的研究.pdf

1、在已婚人群中有將近15％的夫婦存在著不育，而其中近一半是由男性因素引起的。引起男性不育的病因大致可分為：睪丸前性，睪丸性和睪丸后性，睪丸性病因中主要是遺傳因素。而目前遺傳因素中研究較多的是Y染色體。已經(jīng)知道：在男性的性別分化中Y染色體起著非常重要的作用，Y染色體短臂上含有性別決定基因(sex-determingregionYgene，SRY)。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Y染色體異常與男性不育有非常密切的關(guān)系，無論Y染色體數(shù)目異常還是結(jié)構(gòu)異常均可導(dǎo)致男性不育

2、。在Y染色體數(shù)目異常中主要是Y染色體減少或增多以及各種異常核型的嵌合體，它們都可表現(xiàn)為男性生育力下降以致不育。在Y染色體結(jié)構(gòu)異常中，目前研究較多的是Y染色體基因缺失與男性不育的關(guān)系。已發(fā)現(xiàn)Y染色體上存在著精子生成基因或基因家族，稱為無精子因子(azoospermiafactor，AZF)，目前發(fā)現(xiàn)在Y染色體長臂上至少存在AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四個區(qū)域，這些區(qū)域的微缺失與男性不育有著密切關(guān)系。 雖然引起男性不育的已

3、知原因較多，但目前男性不育的病因仍不清楚。在男性因素引起的不育原因中無精子癥大約占了10％。在無精子癥不育男性中睪丸組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)近一半屬于特發(fā)性睪丸精子發(fā)生缺陷，精子發(fā)生缺陷的程度從精子發(fā)生的完全缺乏即唯支持細(xì)胞綜合癥(sertolicell-onlysyndrome，SCOS)到精子發(fā)生部分缺陷，也就是精子成熟阻滯(maturationarrest，MA)和精子發(fā)生程度相對較高的精子發(fā)生低下(hypospermatogenesis，

4、Hypo)。促卵泡激素(folliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH)是一種垂體的糖蛋白激素，它對子維持男性和女性的正常生育功能是必需的。在男性中，F(xiàn)SH決定了睪丸中支持細(xì)胞的數(shù)量以及精子發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量。因此，F(xiàn)SH被認(rèn)為是促使精子發(fā)生和成熟的最重要的激素，其血清水平異?？赡芊从沉瞬G丸內(nèi)精子發(fā)生存在障礙。FSH受體(FSHR)表達(dá)子支持細(xì)胞的漿膜上。FSH通過結(jié)合FSHR后激活G蛋白偶聯(lián)機(jī)制而起作用。FSH受體信號對刺

5、激支持細(xì)胞的增殖以及維持睪丸正常的精子產(chǎn)生是必需的。 盡管研究已發(fā)現(xiàn)AZF區(qū)域微缺失與無精子癥、嚴(yán)重少精子癥有密切關(guān)系，但AZF區(qū)域微缺失與無精子癥患者的睪丸組織學(xué)表型之間的關(guān)系仍不明確，與無精子癥患者的血清促卵泡激素(FSH)水平的關(guān)系也不清楚。盡管已經(jīng)明確FSH及其受體信號對維持睪丸正常的精子產(chǎn)生是必需的，而且也已發(fā)現(xiàn)FSH受體結(jié)合能力的下降與男性不育相關(guān)，但至今仍不明確FSHR在特發(fā)性無精子癥患者睪丸組織中的表達(dá)水平，與精

6、子發(fā)生程度是否存在相關(guān)性，以及無精子癥患者血清FSH水平與睪丸內(nèi)精子存在與否的對應(yīng)關(guān)系。為了弄清這些問題，我們檢測了特發(fā)性無精子癥患者的血清FSH水平、Y染色體AZF區(qū)域微缺失、睪丸的精子發(fā)生程度以及FSHR在不同睪丸組織學(xué)表型中的表達(dá)水平，在此基礎(chǔ)上，探索了Y染色體AZF區(qū)域微缺失與血清FSH水平、睪丸的精子發(fā)生程度的關(guān)系，F(xiàn)SHR在睪丸組織中的表達(dá)水平與精子發(fā)生程度的相關(guān)性，以及血清FSH水平與睪丸內(nèi)精子存在與否的對應(yīng)關(guān)系。

7、 第一部分特發(fā)性無精子癥患者Y染色體基因微缺失研究研究 目的:明確特發(fā)性無精子癥患者Y染色體基因微缺失與睪丸組織表現(xiàn)型之間的關(guān)系；明確特發(fā)性無精子癥患者Y染色體基因微缺失與血清促卵泡激素(FSH)水平的關(guān)系。 研究對象和方法:2002年3月至2005年12月間來我院不孕不育門診就診的特發(fā)性無精子癥患者共126例，其中正常血清FSH水平90例，高血清FSH水平36例。對照組：正常已生育的男性及正常女性各20例?；颊咄庥^正常

8、，睪丸大小正常，均未患過睪丸炎、附睪炎、未服用過棉籽油、染色體核型正常；無其他內(nèi)分泌疾病史及遺傳性疾病史。精液常規(guī)檢查根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)2次無精子，診斷為無精子癥。血清激素黃體生成素(luteinizinghormone，LH)，雄激素(testosterone，T)均在正常范圍。抽取各組新鮮外周靜脈血3ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離得到淋巴細(xì)胞后，使用DNA提取純化試劑盒(Promega公司)進(jìn)行淋巴細(xì)胞裂解，核裂解，去除RNA

9、、蛋白，分離沉淀DNA，三蒸水溶解稀釋，得到基因組DNA?；蚪MDNA提取后行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察是否存在Y染色體基因微缺失。在征得患者同意后，在患者的一側(cè)睪丸，用開窗手術(shù)取得大約0.4×0.4×0.4cm3大小睪丸組織，分成2部分，一部分送病理檢查，判斷睪丸組織病變類型；另一部分則在顯微鏡下觀察有無精子，然后放入清潔密封試管中，-80℃下凍存。 結(jié)果:90例正常血清FSH無精子癥不育男性中發(fā)現(xiàn)6例存在Y染

10、色體序列標(biāo)記位點(diǎn)(sequencetaggedsites，STSs)的微缺失，缺失率為6.7％(6/90)，缺失形式有3種，分別為AZFa(SY82)、AZFa(SY82)+AZFb(SY109+SY131)以及AZFc(SY152+SY254+SY255)，其中3例為單純的AZFa(SY82)微缺失，2例為AZFc(SY152+SY254+SY255)微缺失，1例為AZFa(SY82)+AZFb(SY109+SY131)微缺失。6例存

11、在缺失的患者中4例睪丸活檢鏡下見到精子，睪丸病理檢查結(jié)果提示輕度的睪丸精子發(fā)生低下，而2例未見精子患者睪丸病理檢查結(jié)果提示精子成熟阻滯。在36例高血清FSH無精子癥患者中，共檢出微缺失9例，缺失率達(dá)25.0％，缺失形式有5種，分別為AZFc(SY152)、AZFc(SY152+SY254)+AZFd(SY153)、AZFc(SY152+SY254+SY255)+AZFd(SY153)、AZFc(SY152+SY158+SY255)+AZ

12、Fd(SY153)、AZFb(SY130)+AZFc(SY158+SY254+SY255)+AZFd(SY153)，其中1例患者為AZFc(SY152)缺失，4例為AZFc(SY152+SY254)+AZFd(SY153)缺失，2例為AZFc(SY152+SY254+SY255)+AZFd(SY153)缺失，1例為AZFc(SY152+SY158+SY255)+AZFd(SY153)缺失，最后1例為AZFb(SY130)+AZFc(SY

13、158+SY254+SY255)+AZFd(SY153)。存在缺失的9例患者，其睪丸活檢組織顯微鏡下有3例見到精子，睪丸病理檢查結(jié)果提示輕度的睪丸精子發(fā)生低下，而6例未見精子患者中，5例睪丸病理檢查結(jié)果提示精子成熟阻滯，1例提示唯支持細(xì)胞綜合癥。高血清FSH無精子癥患者Y染色體微缺失率明顯高于正常血清FSH水平患者(P=0.01)。精子發(fā)生低下的無精子癥患者可以存在AFZa、AZFb區(qū)的微缺失，也可存在AZFc、AZFd區(qū)的微缺失；精子

14、成熟阻滯的無精子癥患者也可以存在AZFb、AZFc或AZFd區(qū)的微缺失。 結(jié)論:1.Y染色體基因微缺失是正常和高血清FSH無精子癥患者患病的重要原因之一。2.特發(fā)性無精子癥患者Y染色體基因微缺失類型與其睪丸組織表現(xiàn)型之間無確定的對應(yīng)關(guān)系。3.特發(fā)性無精子癥患者血清FSH水平與Y染色體微缺失發(fā)生率相關(guān)。 第二部分促卵泡激素受體在特發(fā)性無精子癥患者不同睪丸組織學(xué)表型中的表達(dá) 研究目的:明確特發(fā)性無精子癥患者血清FSH

15、水平以及睪丸組織中FSHR的表達(dá)水平與精子發(fā)生程度是否存在相關(guān)性以及在不同的睪丸組織學(xué)表型中是否存在不同的FSHR的表達(dá)水平。 研究對象和方法:2002年3月至2005年12月間來我院不孕不育門診就診的特發(fā)性無精子癥患者共57例。患者外觀正常，睪丸大小正常，均未患過睪丸炎、附睪炎、未服用過棉籽油、染色體核型正常；無其他內(nèi)分泌疾病史及遺傳性疾病史。精液常規(guī)檢查根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)2次無精子，診斷為無精子癥?；颊哐寮に貞?yīng)用電化學(xué)發(fā)光

16、法進(jìn)行測定，黃體生成素(LH)，雄激素(T)均在正常范圍。在征得患者同意后，在患者的一側(cè)睪丸，用開窗手術(shù)取得大約0.4×0.4×0.4cm3大小睪丸組織，分成2部分，一部分送病理檢查，判斷睪丸組織病變類型；另一部分放入清潔密封試管中，-80℃下凍存。57例無精子癥患者睪丸病理組織學(xué)診斷分為三組：精子發(fā)生低下(Hypo)25例，精子成熟阻滯(MA)21例，唯支持細(xì)胞綜合癥(SCOS)11例。對照組：睪丸組織學(xué)診斷精子發(fā)生正常13例。對各組

17、標(biāo)本行實(shí)時熒光RT-PCR法(Real-timeRT-PCR)測定FSHRmRNA的表達(dá)，并進(jìn)行相對定量分析。取各組標(biāo)本石蠟切片用二步法免疫組織化學(xué)法檢測FSHR蛋白的表達(dá)，明確其組織學(xué)定位，并用H-score組織學(xué)積分法對FSHR蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果:睪丸病理組織學(xué)診斷SCOS的無精子癥患者組的血清FSH水平明顯高于其他三組：Hypo組、MA組和正常精子發(fā)生組(P＜0.01)，組織學(xué)診斷MA的患者組的血清FSH水平明