非梗阻性無(wú)精子癥睪丸外科取精及睪丸精子冷凍保存的研究.pdf

1、無(wú)精子癥在一般男性人群的發(fā)生率約為1％，而在存在不育問(wèn)題的男性中約為10％。無(wú)精子癥可分為梗阻性無(wú)精子癥(OA)和非梗阻性無(wú)精子癥(NOA)。睪丸活檢顯示NOA可表現(xiàn)為三種病理類(lèi)型:生精功能低下、成熟阻滯和唯支持細(xì)胞綜合征。在以往，NOA患者被認(rèn)為是無(wú)法治愈的，只能通過(guò)領(lǐng)養(yǎng)或供精解決后代問(wèn)題。在1993年SchoysmanR等人從OA患者的睪丸中提取睪丸精子用于體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)獲得成功。1995年D

2、evroeyP等人從NOA癥患者的睪丸中提取精子并通過(guò)ICSI使卵子成功受精。從此，對(duì)NOA患者的治療而言，關(guān)鍵是如何高效的通過(guò)外科取精方法獲得足夠多的、高質(zhì)量的活動(dòng)精子。為達(dá)此目的，先后出現(xiàn)了幾種從NOA癥患者的睪丸中提取精子的方法。這些方法包括如下:(一)睪丸精子抽吸術(shù)(Testicularspermaspiration，TESA);(二)針吸活檢取精(Needleaspirationbiopsy,NAB);(三)睪丸活檢穿刺針穿刺

3、取精（Cuttingneedlebiopsy，CNB）;(四)睪丸切開(kāi)活檢取精(Testicularspermextraction，TESE);(五)單一曲細(xì)精管活檢術(shù)(Singleseminiferoustubulebiopsy,SSTB);(六)顯微切開(kāi)睪丸切開(kāi)取精(MicrodissectionTESE);(七)B超引導(dǎo)下睪丸取精術(shù)(Ultrasound-guidedtesticularspermextraction)。
　

4、　 如何簡(jiǎn)單、高效的通過(guò)外科方法，從NOA患者的睪丸中獲得精子？對(duì)NOA患者的臨床治療有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 由于每次從NOA患者的睪丸中獲得的精子很少，對(duì)這些睪丸精子的冷凍保存，因其數(shù)量極少，且精子細(xì)胞膜尚未完全成熟，精子核DNA的穩(wěn)定性也較差。采用常規(guī)精液標(biāo)本那樣的冷凍保存辦法已被證明效果很差。近年來(lái)隨著人們對(duì)玻璃化冷凍研究的不斷深入，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到，人類(lèi)的精子可以在不使用冷凍保護(hù)劑的情況下，通過(guò)一種稱(chēng)為玻璃化冷凍方法

5、成功的進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇。這種冷凍方法要求在冷凍和解凍時(shí)，要以很高的降溫速度進(jìn)行[達(dá)到(7.2×105)℃/min]，以實(shí)現(xiàn)精子的玻璃化冷凍，在這一過(guò)程中，極高的凍融速率使得精子內(nèi)外液之間幾乎同步地由液態(tài)轉(zhuǎn)為玻璃態(tài)（冷凍時(shí)），或由玻璃態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)（解凍時(shí)）并無(wú)細(xì)胞內(nèi)外液間的交換，故精子內(nèi)外不會(huì)有冰晶的形成，從而避免了精子內(nèi)產(chǎn)生冰晶對(duì)精子的機(jī)械性損傷，也消除了精子外冰晶形成引起的理化損傷?，F(xiàn)有的研究資料顯示，玻璃化冷凍保存精子，方法簡(jiǎn)單、快速，

6、而且不需專(zhuān)門(mén)的冷凍設(shè)備。研究和探索微量精子的玻璃化冷凍，對(duì)NOA患者的臨床治療亦有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 第一部分兩種外科取精方法在造模少精子癥或無(wú)精子癥大鼠獲精率的比較
　　 目的:比較單個(gè)曲細(xì)精管取精術(shù)和常規(guī)睪丸切開(kāi)取精術(shù)在造模少精子癥或無(wú)精子癥大鼠中的獲精率，以期為臨床找到一種簡(jiǎn)單、微創(chuàng)和高效的針對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥的外科取精方法。
　　 方法:45只實(shí)驗(yàn)雄性大鼠分A、B、C、D、E、F、G、H和I共九組。A

7、組、B組和C組，每組9只大鼠;D組、E組、F組、G組、H組和I組，每組3只大鼠。每只實(shí)驗(yàn)大鼠一次性腹腔注射白消安和環(huán)磷酰胺，劑量分別為5mg/kg和40mg/kg（A組），5mg/kg和80mg/kg(B組)，5mg/kg和120mg/kg（C組），10mg/kg和40mg/kg（D組），10mg/kg和80mg/kg(E組)，10mg/kg和120mg/kg（F組），15mg/kg和40mg/kg（G組），15mg/kg和80mg/k

8、g(H組)，15mg/kg和120mg/kg（I組）。注射后將九組大鼠混合后常規(guī)飼養(yǎng)。于注射后第15天、第20天、第25天和第30天，每次隨機(jī)取7只大鼠用于實(shí)驗(yàn);第35天將剩余的大鼠全部用于實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有10只大鼠死亡，共有35只大鼠最終接受了睪丸外科取精子術(shù)。對(duì)每只接受睪丸外科取術(shù)的大鼠，實(shí)驗(yàn)方法為同一大鼠的一側(cè)睪丸采用單個(gè)曲細(xì)精管取精，另一側(cè)睪丸采用常規(guī)睪丸切開(kāi)取精。兩種取精方法所獲得的睪丸組織處理后立即制成濕片，在倒置顯微

9、鏡下放大200倍尋找精子。
　　 結(jié)果:45只實(shí)驗(yàn)大鼠，造模后10只死亡，最終進(jìn)入實(shí)驗(yàn)性外科取精的大鼠35只。采用單個(gè)曲細(xì)精管活檢取精方法共活檢35只造模大鼠的一側(cè)睪丸，獲精率為65.7％(23/35);采用常規(guī)睪丸切開(kāi)活檢取精方法活檢其另一側(cè)睪丸，獲精率為40％(14/35)。
　　 第二部分采用不同的微載體和不同的冷凍方法對(duì)小鼠睪丸單個(gè)精子冷凍復(fù)蘇效果的比較
　　 目的:比較采用不同的微載體和不同的冷凍方法對(duì)

10、小鼠睪丸單個(gè)精子的冷凍復(fù)蘇效果，以期為臨床找到一種簡(jiǎn)單、高效的，針對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥患者睪丸微量精子的冷凍保存方法。
　　 方法:10周齡雄性昆明小鼠，通過(guò)睪丸切開(kāi)活檢取精法，獲得睪丸組織，物理研碎后，經(jīng)體外培養(yǎng)，單層密度梯度離心后獲得小鼠的睪丸精子。A組采用透明帶不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍;B組采用ICSI針不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍;C組采用透明帶常規(guī)冷凍;D組采用ICSI針常規(guī)冷凍，每組各冷凍50個(gè)小鼠睪丸活動(dòng)精子。比較精

11、子復(fù)蘇后的回收率和活動(dòng)率兩項(xiàng)指標(biāo)。
　　 結(jié)果:A組解凍復(fù)蘇后精子回收率為96.0％(48/50)，精子活動(dòng)率為89.6％(43/48);B組解凍復(fù)蘇后精子回收率為84.0％(42/50)，精子活動(dòng)率為95.2％(40/42);C組解凍復(fù)蘇后精子回收率為98.0％(49/50)，精子活動(dòng)率為61.2％(30/49);D組解凍復(fù)蘇后精子回收率為90.0％(45/50)，精子活動(dòng)率為68.9％(31/45)。
　　 第三部分

12、小鼠睪丸單個(gè)精子的玻璃化冷凍對(duì)卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射治療結(jié)果的影響
　　 目的:了解不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化法冷凍小鼠睪丸精子對(duì)卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射治療結(jié)果的影響。
　　 方法:通過(guò)睪丸切開(kāi)活檢取精方法獲得小鼠睪丸精子。玻璃化冷凍組為采用不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化法冷凍復(fù)蘇后的小鼠睪丸精子，新鮮組為來(lái)自小鼠睪丸的新鮮精子，兩組精子均采用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射方法使卵子受精，比較兩組的2-細(xì)胞胚胎的受精率。
　　 結(jié)果:玻璃化冷凍

13、組共注射48個(gè)成熟卵子，2-細(xì)胞胚胎37個(gè)，2-細(xì)胞胚率為77.1％;新鮮組共注射55個(gè)成熟卵子，2-細(xì)胞胚胎44個(gè)，2-細(xì)胞胚率為80.0％。
　　 結(jié)論:
　　 1.和常規(guī)睪丸切開(kāi)取精子方法相比，單個(gè)曲細(xì)精管活檢取精子方法獲精率更高，而且操作簡(jiǎn)單對(duì)睪丸創(chuàng)傷小，值得在NOA患者的睪丸取精中推廣。
　　 2.在對(duì)來(lái)自睪丸的單個(gè)精子進(jìn)行冷凍保存時(shí)，采用空透明帶作為微載體在解凍復(fù)蘇后精子回收率方面優(yōu)于ICSI針，但采